Barış Genç et al. 臨床翻訳医学。 2021年2月
背景: 上位運動ニューロン (UMN) は、運動ニューロン回路の重要なコンポーネントです。それらの変性は、遺伝性痙性対麻痺 (HSP)、原発性側索硬化症 (PLS)、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの疾患の特徴です。現在、UMN の疾患であっても、複合治療に対する UMN の細胞反応を調査する前臨床アッセイはありません。 UMN の脆弱性の基礎は完全には理解されておらず、罹患した UMN の健康を改善する化合物はまだ特定されていません。これは、効果的な治療戦略を構築するための 2 つの大きな障害となっています。
メソッド: ミスフォールドスーパーオキシドジスムターゼタンパク質（mSOD1）の毒性とTDP-43の病理により罹患したUMNをeGFP発現で標識する新規UMNレポーターモデルにより、化合物治療に対するUMNの反応を直接評価することが可能となる。電子顕微鏡では、小胞体 (ER) とミトコンドリアの損傷の非常に正確な側面が明らかになります。 NU-9 の投与は、mSOD1 毒性を軽減する能力に基づいて最初に同定された化合物であり、詳細な細胞および超微細構造分析によって確認されたように、UMN の健康と安定性の改善に重大な影響を及ぼします。
結果: ミトコンドリアと小胞体に関する問題は、さまざまな種の病気の UMN に保存されています。 NU-9 は薬物のような薬物動態特性を持っています。毒性がなく、血液脳関門を通過します。 NU-9 は、ミトコンドリアと ER の構造的完全性を改善し、mSOD1 のレベルを低下させ、変性している UMN の頂端樹状突起を安定化し、ハンギング ワイヤー テストで測定される運動行動を改善し、運動ニューロン変性の 2 つの異なる重要な主要な原因である mSOD1 毒性と TDP-43 病理の両方により疾患となる進行中の UMN の変性を排除します。
結論: メカニズムに焦点を当てた細胞ベースの創薬アプローチは、UMN喪失の原因となる主要な細胞欠陥に対処しただけでなく、ALS、HSP、PLS、およびALS/FTLD患者において変性するニューロンである疾患のあるUMNの健康を改善する最初の化合物であるNU-9も同定した。
キーワード: ALS; HSP; NU-9;お願いします; TDP-43の病理; mSOD1;上位運動ニューロン。
© 2021 著者。 Clinical and Translational Medicine は、上海臨床バイオインフォマティクス研究所に代わって John Wiley &Sons Australia, Ltd によって出版されています。
PubMed の免責事項
著者は利益相反がないことを宣言します。
図 1 筋萎縮性側索硬化症（ALS）患者や、さまざまな根本的な原因により疾患を患ったマウスモデルでは、上部運動ニューロン（UMN）に超微細構造欠陥が見られます。 (A) 正常対照の UMN の代表的な電子顕微鏡 (EM) 画像は無傷であるように見えますが、(B) ALS 患者の UMN は細胞構築上の欠陥を示しています。 (C) WT マウスの UMN の EM 画像。 (D) hSOD1G93A の UMN の代表的な EM 画像、および (E) 大規模な超微細構造崩壊を示す prpTDP-43A315T マウス。 (F) 無傷のミトコンドリア内膜を示す正常対照のミトコンドリア(矢印)、(G) ミトコンドリア内膜の崩壊を示すALS患者のミトコンドリア(矢印)とは対照的。 (H) WT マウスのミトコンドリアは構造的に無傷で、ミトコンドリア内膜と外膜が異なっているように見えます (矢印)。一方、(I) hSOD1G93A マウスおよび (J) prpTDP-43A315T マウスの UMN 内のミトコンドリアは、ミトコンドリア内膜の重度の崩壊を示しています (矢印)。 (K) 正常対照における UMN 小胞体 (ER) の電子顕微鏡写真では、適切に積み重ねられた長い槽 (矢印) が表示されますが、(L) ALS 患者の ER では、ER 槽の膨張とバルーン化が示されています (矢印)。同様に、WT マウスの (M) ER (矢印) は、壊れ、短く、崩壊した ER 槽 (矢印) を示す hSOD1G93A の UMN の (N) ER および (O) prpTDP-43A315T マウスの ER とは対照的に、構造的に無傷であるように見えます (矢印)。 (P) ALS 患者における細胞構築欠陥/UMN を伴う ER の平均パーセンテージの定量化。 ****p <.0001、スチューデントの t 検定。 (Q) hSOD1G93A における細胞構築欠陥/UMN を伴う ER の平均パーセンテージの定量化。 ****p <.0001、および prpTDP-43A315T マウス。 ****p <.0001、一元配置分散分析とその後の Tukey の事後多重比較検定。 (R) ALS 患者における ER 槽/UMN の平均長の定量化。 **p <.001、スチューデントの t 検定。 (S) hSOD1G93A **** p <.0001、および prpTDP-43A315T マウスにおける小胞体槽/UMN の平均長の定量化。 ****p <.0001、一元配置分散分析とその後の Tukey の事後多重比較検定。スケール バー:A – E =2 μm。 F–O =200 nm
図 2 NU-9 治療は、変異型 SOD1 毒性により疾患を患った上部運動ニューロン (UMN) のミトコンドリアと小胞体 (ER) の両方の超微細構造の完全性を改善します。 (A) ヒットから NU-9 に至るまでの進行 (NU-9 の化学構造)。 (B) in vivo 研究のための実験デザイン。 （C〜F）P120でビヒクルで処理したWT-UeGFPマウスの運動皮質におけるUMNの代表的な電子顕微鏡（EM）画像。矢印は、内膜が無傷のミトコンドリアと槽が無傷のERを示しています。スケールバー、C:2μm; D-F:200 nm。 （G〜J）P120でビヒクルで処理したhSOD1G93A-UeGFPマウスの運動皮質におけるUMNの代表的なEM画像。 (G) 細胞質には主要な重要な細胞小器官がほとんどなく、(H) 多数の電子密度の高い凝集体 (矢じり) と大きな液滴が存在します。 (I) 内膜の完全性を失ったミトコンドリア (矢頭)、または全体的な構造損傷があるミトコンドリア、および (J) ER の断片化した断片 (矢頭) が明らかです。スケールバー、G:2μm; H-J:200 nm。 (K – N) 100 mg/kg/日の NU-9 で治療した hSOD1G93A-UeGFP マウスの運動皮質における UMN の代表的な EM 画像。 (K) 多数の細胞小器官の存在による細胞質の全体的な改善。 (L) ミトコンドリアは健康であるように見え (矢印)、細胞質には主要な高密度の凝集体や液滴がありません。 (M) ミトコンドリア内膜とクリステ構造の完全性が回復し (矢印)、(N) ER 槽 (矢印) が断片化することなく適切な構造で配置されています。スケールバー、I:2μm; L-N:200 nm。 (O) NU-9 治療を受けた hSOD1G93A-UeGFP マウスにおけるミトコンドリア/UMN の総数の定量化。 **p <.006、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後多重比較検定。 (P) NU-9 治療を受けた hSOD1G93A-UeGFP マウスにおける健康なミトコンドリア/UMN のパーセンテージの定量化。 ****p <.0001、一元配置分散分析とその後の Tukey の事後多重比較検定。 (Q) NU-9 治療を受けた hSOD1G93A-UeGFP マウスにおける小胞体槽/UMN の数の定量化。 *p <.016、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後多重比較検定。 (R) NU-9 治療を受けた hSOD1G93A-UeGFP マウスにおける小胞体槽/UMN の平均長の定量化。 **p <.002、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後多重比較検定
図 3 NU-9 治療は、hSOD1G93A-UeGFP マウスの上部運動ニューロン (UMN) におけるミスフォールド SOD1 レベルを低下させます。 （A）WT-UeGFP または（B）ビヒクル、（C）20 mg/kg/日 NU-9、または（D）100 mg/kg/日 NU-9 で処置した hSOD1G93A-UeGFP マウスの運動皮質におけるミスフォールド SOD1 タンパク質を認識する UMN および B8H10 抗体染色の代表的な画像。スケールバー、20μm。 n ≥ 3 生物学的複製。 （E）ビヒクル、20 mg/kg/日 NU-9、または 100 mg/kg/日 NU-9 で処置した WT-UeGFP または hSOD1G93A-UeGFP マウスの運動皮質における UMN におけるミスフォールド SOD1 蛍光の平均積分密度。平均値、SEM、および個々のデータポイントは、n ≥ 3 の生物学的複製について示されています。 **p <.01、****p <.0001、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後多重比較検定
図 4 NU-9 治療は、ミスフォールド SOD1 毒性により疾患を発症した上部運動ニューロン (UMN) の崩壊しつつある頂端樹状突起の細胞構築の完全性を改善します。 （A）ビヒクル、（C）20 mg/kg/日 NU-9、または（D）100 mg/kg/日 NU-9 で処理された WT-UeGFP または（B）hSOD1G93A-UeGFP マウスの運動皮質における UMN 頂端樹状突起の代表的な画像。ボックスで囲まれた領域は右側に拡大され、追加の例が提供されます。スケールバー：50μm（低倍率）、10μm（高倍率挿入図）。 n ≥ 6 生物学的複製。 (E) 健康で無傷の代表的な画像、および (F) 病気で崩壊しつつある頂端樹状突起の代表的な画像。スケール バー:5 μm。 (G) 運動皮質のセクションあたりの液胞を含む UMN 頂端樹状突起の平均パーセンテージ。平均値、SEM、および個々のデータポイントは、n ≥ 6 の生物学的複製について示されています。 *p <.05、**p <.01、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後多重比較検定
図 5 NU-9 治療は、in vivo でミスフォールド SOD1 毒性に起因する疾患のある上部運動ニューロン (UMN) 変性を軽減します。 （A〜D）ビヒクル、20 mg/kg/日のNU-9、または100 mg/kg/日のNU-9で治療したWT-UeGFPまたはhSOD1G93A-UeGFPマウスの運動皮質におけるUMNの代表的な画像。スケールバー:50 μm。 n ≥ 5 生物学的複製。 (E) 運動皮質のセクションあたりの UMN の平均数。平均値、SEM、および個々のデータポイントは、n ≥ 5 の生物学的複製について示されています。 *p <.05、***p <.001、****p <.0001、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後多重比較検定
図 6 NU-9 治療は、TDP-43 の病理により疾患を患った上部運動ニューロン (UMN) のミトコンドリアと小胞体 (ER) の両方の超微細構造の完全性を改善します。 prpTDP-43A315T-UeGFP マウスの UMN におけるミトコンドリアおよび ER 欠損は以前に発表されました。 (A – C) 未処理の prpTDP-43A315T-UeGFP マウスの UMN の代表的な電子顕微鏡画像。 (A) 無傷の細胞小器官がほとんどない UMN 細胞体。 (B) ミトコンドリアは内膜の完全性を失い (矢印)、(C) ER 槽は崩壊して壊れます (矢印)。 (D – F) 100 mg/kg/日の NU-9 で治療した prpTDP-43A315T-UeGFP マウスの UMN の代表的な電子顕微鏡画像。 (D) 細胞構造の全体的な改善は、適切な核膜、多数の健康な細胞小器官の存在、および電子密度の高い凝集体の欠如によって証明されています。 (E) ミトコンドリアは内膜とクリステが改善され (矢印) (F)、ER 槽はリボソームが結合して適切な構造に配置され (矢印)、健康に見えます。スケールバー：A、D：2μm。 B、C、E、F:200 nm。 (G) 100 mg/kg/日の NU-9 治療を受けた prpTDP-43A315T-UeGFP マウスにおけるミトコンドリア/UMN の総数の定量化。 *p <.03。 (H) 100 mg/kg/日の NU-9 治療を受けた prpTDP-43A315T-UeGFP マウスにおける健康なミトコンドリア/UMN の割合の定量化。 ****p <.0001。 (I) 100 mg/kg/日の NU-9 治療を受けた prpTDP-43A315T-UeGFP マウスにおける小胞体槽/UMN の数の定量化。 ***p <.0003。 (J) 100 mg/kg/日の NU-9 治療を受けた prpTDP-43A315T-UeGFP マウスにおける小胞体槽/UMN の平均長の定量化。 ****p <.0001。統計分析には、一元配置分散分析とその後の Tukey の事後多重比較検定が使用されました。
図 7 NU-9 治療は、崩壊しつつある頂端樹状突起の細胞構築の完全性を改善し、TDP-43 の病状により疾患を引き起こす上位運動ニューロン (UMN) の進行性変性を排除します。 （A）未治療の prpTDP-43A315T-UeGFP マウスと、（B）100 mg/kg/日の NU-9 で治療した prpTDP-43A315T-UeGFP マウスの運動皮質における UMN 頂端樹状突起の代表的な画像。ボックス領域は右側に拡大され、追加の代表的な例が示されています。スケールバー：50μm（低倍率）、10μm（高倍率挿入図）。 n ≥ 3 生物学的複製。 (C) 健康で無傷の代表的な画像、および (D) 病気で崩壊しつつある先端樹状突起の代表的な画像。スケール バー:5 μm。 (E) 運動皮質の断面積当たりの液胞を含む頂端樹状突起の平均パーセンテージ。平均値、SEM、および個々のデータポイントは、n ≥ 3 の生物学的複製について示されています。 **p <.01、***p <.001、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後多重比較検定。 （F）未治療のprpTDP-43A315T-UeGFPマウスの運動皮質におけるUMNの代表的な画像、および（G）100 mg/kg/日のNU-9で治療したprpTDP-43A315T。スケールバー:50 μm。 n ≥ 3 生物学的複製。 (H) 運動皮質の断面積あたりの UMN の平均数。平均値、SEM、および個々のデータポイントは、n ≥ 3 の生物学的複製について示されています。 *p <.05、**p <.01、***p <.001、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後多重比較検定
図 8 NU-9 治療は、生体内でのミスフォールド SOD1 毒性に起因する下位運動ニューロン (LMN) 変性を改善しません。 (A および B) 未治療の prpTDP-43A315T-UeGFP マウスまたは 100 mg/kg/日の NU-9 で治療したマウスの腰髄における LMN の代表的な画像。スケールバー:50μm; n ≥ 3 生物学的複製。 （C〜F）ビヒクル、20 mg/kg/日のNU-9、または100 mg/kg/日のNU-9で治療したWT-UeGFPまたはhSOD1G93A-UeGFPマウスの腰椎脊髄におけるLMNの代表的な画像。スケールバー:50μm; n =5 生物学的複製。 (G) 腰部脊髄のセクションあたりの ChAT+ LMN の平均数。平均値、SEM、および個々のデータポイントは、n =5 の生物学的複製について示されています。 ****p <.0001、一元配置分散分析とその後の Tukey の事後多重比較検定。 (H) 腰椎脊髄のセクションごとの NeuN+/ChAT+ LMN (変性を受けやすい) の平均数。平均値、SEM、および個々のデータポイントは、n =5 の生物学的複製について示されています。 ****p <.0001、一元配置分散分析とその後の Tukey の事後多重比較検定。 (I) 腰部脊髄の切片あたりの GFP+/ChAT+ LMN (変性に対する耐性) の平均数。 n =5 の生物学的複製について示された平均値、SEM、および個々のデータポイント
図 9 NU-9 治療の有無にかかわらず、WT-UeGFP、hSOD1G93A-UeGFP、および prpTDP-43A315T-UeGFP マウスの行動データ。 WT-UeGFP マウスと hSOD1G93A-UeGFP マウスは、生後 (P) 60 日から P120 まで 7 日ごとに検査されました。 prpTDP-43A315T-UeGFP マウスを P60、P90、および P120 でテストしました。 (A) マウスの重量 (グラム単位)。平均値と標準誤差は、1 グループあたり n ≧ 5 マウスについて示されています。 WT-UeGFP (ビヒクル) 対 hSOD1G93A-UeGFP (ビヒクル)。 #p <.05、Tukey の多重比較検定による二元配置分散分析。 (B) 加速中のロータロッドに落ちるまでの待ち時間 (秒単位)。平均値と標準誤差は、1 グループあたり n ≧ 5 マウスについて示されています。 WT-UeGFP (ビヒクル) 対 hSOD1G93A-UeGFP (ビヒクル)。 #p <.05、##p <.01、###p <.001、####p <.0001、Tukey の多重比較検定による二元配置分散分析。 (C) ワイヤー グリッドから逆さまにぶら下がって落下するまでの待ち時間 (数秒)。平均値と標準誤差は、1 グループあたり n ≧ 5 マウスについて示されています。 WT-UeGFP (ビヒクル) 対 hSOD1G93A-UeGFP (ビヒクル)。 #p <.05、###p <.001、####p <.0001; hSOD1G93A-UeGFP (ビヒクル) 対 hSOD1G93A-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/日)。 *p <.05、***p <.001、****p <.0001、Tukey の多重比較検定による二元配置分散分析。 (D) 加速中のロータロッドに到達するまでの待ち時間 (秒単位)。平均値と標準誤差は、グループあたり n ≥ 4 マウスについて示されています。 WT-UeGFP (ビヒクル) 対 prpTDP-43A315T-UeGFP (ビヒクル)。 ##p <.01、####p <.0001、Tukey の多重比較検定による混合効果分析。 (E) ワイヤー グリッドから逆さまにぶら下がって落下するまでの待ち時間 (数秒)。平均値と SEM は、1 グループあたり n ≧ 3 匹のマウスについて示されています。 WT-UeGFP (ビヒクル) 対 prpTDP-43A315T-UeGFP (ビヒクル)、####p <.0001; prpTDP-43A315T-UeGFP (未治療) 対 prpTDP-43A315T-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/日)、****p <.0001、Tukey の多重比較検定による混合効果分析