Barış Genç et al. Clin Transl Med. 2021 febbraio
Sfondo: I motoneuroni superiori (UMN) sono un componente chiave dei circuiti dei motoneuroni. La loro degenerazione è un segno distintivo di malattie come la paraplegia spastica ereditaria (HSP), la sclerosi laterale primaria (PLS) e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Attualmente non esistono test preclinici che indaghino le risposte cellulari degli UMN al trattamento con composti, anche per le malattie degli UMN. Le basi della vulnerabilità degli UMN non sono completamente comprese e non è stato ancora identificato alcun composto in grado di migliorare la salute degli UMN malati:due importanti ostacoli alla costruzione di strategie di trattamento efficaci.
Metodi: Nuovi modelli reporter UMN, in cui gli UMN malati a causa della tossicità della proteina superossido dismutasi (mSOD1) mal ripiegata e della patologia TDP-43 sono etichettati con l'espressione eGFP, consentono la valutazione diretta della risposta dell'UMN al trattamento del composto. La microscopia elettronica rivela aspetti molto precisi del reticolo endoplasmatico (ER) e del danno mitocondriale. La somministrazione di NU-9, un composto inizialmente identificato in base alla sua capacità di ridurre la tossicità di mSOD1, ha un profondo impatto sul miglioramento della salute e della stabilità degli UMN, come identificato da analisi cellulari e ultrastrutturali dettagliate.
Risultati: Problemi con i mitocondri e l'ER sono conservati negli UMN malati tra le diverse specie. NU-9 ha proprietà farmacocinetiche simili a quelle dei farmaci. Non ha tossicità e attraversa la barriera ematoencefalica. NU-9 migliora l'integrità strutturale dei mitocondri e dell'ER, riduce i livelli di mSOD1, stabilizza i dendriti apicali dell'UMN in degenerazione, migliora il comportamento motorio misurato dal test del filo sospeso ed elimina la degenerazione in corso degli UMN che si ammalano sia a causa della tossicità di mSOD1 che della patologia TDP-43, due distinte e importanti cause generali di degenerazione dei motoneuroni.
Conclusioni: Gli approcci alla scoperta di farmaci incentrati sui meccanismi e basati sulle cellule non solo hanno affrontato i principali difetti cellulari responsabili della perdita di UMN, ma hanno anche identificato NU-9, il primo composto in grado di migliorare la salute degli UMN malati, neuroni che degenerano nei pazienti con SLA, HSP, PLS e SLA/FTLD.
Parole chiave: SLA; PAS; NU-9; Per favore; patologia TDP-43; mSOD1; motoneuroni superiori.
© 2021 Gli Autori. Clinical and Translational Medicine pubblicato da John Wiley &Sons Australia, Ltd per conto dello Shanghai Institute of Clinical Bioinformatics.
Dichiarazione di non responsabilità di PubMed
Gli autori dichiarano che non esiste conflitto di interessi.
FIGURA 1 I motoneuroni superiori (UMN) mostrano difetti ultrastrutturali nei pazienti con sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e nei modelli murini malati a causa di diverse cause sottostanti. (A) L'immagine rappresentativa al microscopio elettronico (EM) dell'UMN del controllo normale appare intatta mentre (B) l'UMN del paziente SLA mostra difetti citoarchitettonici. (C) Immagine EM dell'UMN del topo WT. (D) Immagine EM rappresentativa dell'UMN di hSOD1G93A e (E) topo prpTDP-43A315T che mostra una massiccia disintegrazione ultrastrutturale. (F) I mitocondri in un controllo normale mostrano membrane mitocondriali interne intatte (frecce), al contrario dei mitocondri (G) in pazienti affetti da SLA che mostrano la disintegrazione della membrana mitocondriale interna (punte di freccia). (H) I mitocondri nel topo WT sembrano essere strutturalmente intatti con membrane mitocondriali interne ed esterne distinte (freccia), mentre (I) i mitocondri nell'UMN in un topo hSOD1G93A e (J) prpTDP-43A315T mostrano una grave disintegrazione delle membrane mitocondriali interne (punte di freccia). (K) Le micrografie elettroniche del reticolo endoplasmatico (ER) dell'UMN in un controllo normale mostrano lunghe cisterne correttamente impilate (frecce), ma (L) l'ER in un paziente con SLA mostra distensione e rigonfiamento delle cisterne dell'ER (punte di freccia). Allo stesso modo, (M) ER in un topo WT (frecce) sembra strutturalmente intatto in contrasto con (N) ER in UMN di hSOD1G93A e (O) topo prpTDP-43A315T che mostra cisterne ER rotte, corte e disintegrate (punte di freccia). (P) Quantificazione della percentuale media di ER con difetti citoarchitettonici/UMN nei pazienti con SLA. ****p < .0001, test t di Student. (Q) Quantificazione della percentuale media di ER con difetti citoarchitettonici/UMN in hSOD1G93A. ****p < .0001 e topi prpTDP-43A315T. ****p < .0001, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. (R) Quantificazione della lunghezza media delle cisterne ER/UMN nei pazienti con SLA. **p < .001, test t di Student. (S) Quantificazione della lunghezza media delle cisterne ER/UMN nei topi hSOD1G93A **** p < .0001 e prpTDP-43A315T. ****p < .0001, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. Barre della scala:A–E = 2 μm; F–O = 200 nm
FIGURA 2 Il trattamento con NU-9 migliora l’integrità ultrastrutturale sia dei mitocondri che del reticolo endoplasmatico (ER) dei motoneuroni superiori (UMN) che si ammalano a causa della tossicità della SOD1 mutante. (A) Progressione da colpo a piombo a NU-9 con struttura chimica di NU-9. (B) Disegno sperimentale per studi in vivo. (C – F) Immagini rappresentative al microscopio elettronico (EM) degli UMN nella corteccia motoria dei topi WT-UeGFP trattati con veicolo a P120. Le frecce indicano i mitocondri con la membrana interna intatta e il RE con cisterne intatte. Barre della scala, C:2 μm; D-F:200 nm. (G – J) Immagini EM rappresentative degli UMN nella corteccia motoria dei topi hSOD1G93A-UeGFP trattati con veicolo a P120. (G) Il citoplasma è per lo più privo dei principali organelli chiave e (H) sono presenti numerosi aggregati densi di elettroni (punte di freccia) e grandi goccioline. (I) Sono evidenti mitocondri che hanno perso l'integrità della membrana interna (punte di freccia) o presentano danni strutturali complessivi e (J) pezzi frammentati del RE (punte di freccia). Barre della scala, G:2 μm; H–J:200 nm. (K–N) Immagini EM rappresentative degli UMN nella corteccia motoria dei topi hSOD1G93A-UeGFP trattati con 100 mg/kg/giorno di NU-9. (K) Miglioramento generale del citoplasma con la presenza di numerosi organelli. (L) I mitocondri sembrano essere sani (frecce) e il citoplasma è privo di aggregati e goccioline densi. (M) L'integrità della membrana mitocondriale interna e della struttura delle creste viene ripristinata (frecce) e (N) le cisterne ER (frecce) sono disposte nella struttura corretta senza alcuna frammentazione. Barre della scala, I:2 μm; L-N:200 nm. (O) Quantificazione del numero totale di mitocondri/UMN nei topi hSOD1G93A-UeGFP con trattamento NU-9. **p < .006, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. (P) Quantificazione della percentuale di mitocondri/UMN sani nei topi hSOD1G93A-UeGFP con trattamento NU-9. ****p < .0001, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. (Q) Quantificazione del numero di cisterne ER/UMN nei topi hSOD1G93A-UeGFP con trattamento NU-9. *p < .016, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. (R) Quantificazione della lunghezza media delle cisterne ER/UMN nei topi hSOD1G93A-UeGFP con trattamento NU-9. **p < .002, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey
FIGURA 3 Il trattamento con NU-9 riduce i livelli di SOD1 mal ripiegati nei motoneuroni superiori (UMN) dei topi hSOD1G93A-UeGFP. (A) Immagini rappresentative di UMN e colorazione dell'anticorpo B8H10 che riconosce la proteina SOD1 mal ripiegata nella corteccia motoria di topi WT-UeGFP o (B) hSOD1G93A-UeGFP trattati con veicolo, (C) 20 mg/kg/giorno NU-9 o (D) 100 mg/kg/giorno NU-9. Barre di scala, 20 μm; n ≥ 3 repliche biologiche. (E) Densità integrata media della fluorescenza SOD1 mal ripiegata negli UMN nella corteccia motoria dei topi WT-UeGFP o hSOD1G93A-UeGFP trattati con veicolo, 20 mg/kg/giorno NU-9 o 100 mg/kg/giorno NU-9; media, SEM e punti dati individuali mostrati per n ≥ 3 repliche biologiche. **p < .01, ****p < .0001, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey
FIGURA 4 Il trattamento con NU-9 migliora l’integrità citoarchitettonica dei dendriti apicali in disintegrazione dei motoneuroni superiori (UMN) che si ammalano a causa della tossicità di SOD1 mal ripiegata. (A) Immagini rappresentative dei dendriti apicali UMN nella corteccia motoria di topi WT-UeGFP o (B) hSOD1G93A-UeGFP trattati con veicolo, (C) 20 mg/kg/giorno NU-9 o (D) 100 mg/kg/giorno NU-9. Le aree riquadrate vengono ingrandite a destra e vengono forniti ulteriori esempi. Barre della scala:50 μm (bassa magnitudine), 10 μm (riquadro alta magnitudine); n ≥ 6 repliche biologiche. (E) Immagine rappresentativa di un dendrite apicale sano, intatto e (F) malato e in disintegrazione. Barre di scala:5 μm. (G) Percentuale media di dendriti apicali UMN con vacuoli per sezione nella corteccia motoria; media, SEM e punti dati individuali mostrati per n ≥ 6 repliche biologiche. *p < .05, **p < .01, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey
FIGURA 5 Il trattamento con NU-9 riduce la degenerazione dei motoneuroni superiori (UMN) degli UMN malati derivante dalla tossicità di SOD1 mal ripiegata in vivo. (A-D) Immagini rappresentative degli UMN nella corteccia motoria di topi WT-UeGFP o hSOD1G93A-UeGFP trattati con veicolo, 20 mg/kg/giorno NU-9 o 100 mg/kg/giorno NU-9. Barre di scala:50 μm; n ≥ 5 repliche biologiche. (E) Numero medio di UMN per sezione nella corteccia motoria; media, SEM e punti dati individuali mostrati per n ≥ 5 repliche biologiche. *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey
FIGURA 6 Il trattamento con NU-9 migliora l’integrità ultrastrutturale sia dei mitocondri che del reticolo endoplasmatico (ER) dei motoneuroni superiori (UMN) che si ammalano a causa della patologia TDP-43. Difetti mitocondriali ed ER negli UMN dei topi prpTDP-43A315T-UeGFP erano stati precedentemente pubblicati. (A-C) Immagini microscopiche elettroniche rappresentative di UMN di topi prpTDP-43A315T-UeGFP non trattati. (A) Soma UMN, con pochi organelli intatti. (B) I mitocondri perdono l'integrità della loro membrana interna (punte di freccia) e (C) le cisterne ER sono disintegrate e rotte (punte di freccia). (D-F) Immagini al microscopio elettronico rappresentative degli UMN di topi prpTDP-43A315T-UeGFP trattati con 100 mg/kg/giorno di NU-9. (D) Un miglioramento complessivo della citoarchitettura è evidenziato da una corretta membrana nucleare, dalla presenza di numerosi organelli sani e dalla mancanza di aggregati densi di elettroni. (E) I mitocondri appaiono sani con membrana interna e creste migliorate (freccia) (F) e cisterne ER disposte in una struttura adeguata con ribosomi attaccati (frecce). Barre della scala:A,D:2 μm; B,C,E,F:200 nm. (G) Quantificazione del numero totale di mitocondri/UMN nei topi prpTDP-43A315T-UeGFP con trattamento NU-9 da 100 mg/kg al giorno; *p < .03. (H) Quantificazione della percentuale di mitocondri/UMN sani nei topi prpTDP-43A315T-UeGFP con trattamento NU-9 da 100 mg/kg/giorno; ****p < .0001. (I) Quantificazione del numero di cisterne ER/UMN nei topi prpTDP-43A315T-UeGFP con trattamento NU-9 da 100 mg/kg al giorno; ***p < .0003. (J) Quantificazione della lunghezza media delle cisterne ER/UMN nei topi prpTDP-43A315T-UeGFP con trattamento NU-9 da 100 mg/kg al giorno; ****p < .0001. Per le analisi statistiche è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey
FIGURA 7 Il trattamento NU-9 migliora l’integrità citoarchitettonica dei dendriti apicali in disintegrazione ed elimina la progressiva degenerazione dei motoneuroni superiori (UMN) che si ammalano a causa della patologia TDP-43. (A) Immagini rappresentative dei dendriti apicali UMN nella corteccia motoria di topi prpTDP-43A315T-UeGFP non trattati e (B) topi prpTDP-43A315T-UeGFP trattati con 100 mg/kg/giorno di NU-9. L'area nel riquadro viene ingrandita a destra con ulteriori esempi rappresentativi. Barre della scala:50 μm (bassa magnitudine), 10 μm (riquadro alta magnitudine); n ≥ 3 repliche biologiche. (C) Immagine rappresentativa di un dendrite apicale sano, intatto e (D) malato e disintegrato. Barre di scala:5 μm. (E) Percentuale media di dendriti apicali con vacuoli per area di sezione nella corteccia motoria; media, SEM e punti dati individuali mostrati per n ≥ 3 repliche biologiche. **p < .01, ***p < .001, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. (F) Immagini rappresentative di UMN nella corteccia motoria di topi prpTDP-43A315T-UeGFP non trattati e (G) prpTDP-43A315T trattati con 100 mg/kg/giorno di NU-9. Barre di scala:50 μm; n ≥ 3 repliche biologiche. (H) Numero medio di UMN per area di sezione nella corteccia motoria; media, SEM e punti dati individuali mostrati per n ≥ 3 repliche biologiche. *p < .05, **p < .01, ***p < .001, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey
FIGURA 8 Il trattamento con NU-9 non migliora la degenerazione dei motoneuroni inferiori (LMN) derivante dalla tossicità di SOD1 mal ripiegata in vivo. (A e B) Immagini rappresentative di LMN nel midollo spinale lombare di topi prpTDP-43A315T-UeGFP non trattati o trattati con 100 mg/kg/giorno di NU-9. Barra della scala:50 μm; n ≥ 3 repliche biologiche. (C-F) Immagini rappresentative di LMN nel midollo spinale lombare di topi WT-UeGFP o hSOD1G93A-UeGFP trattati con veicolo, 20 mg/kg/giorno di NU-9 o 100 mg/kg/giorno di NU-9. Barra della scala:50 μm; n = 5 repliche biologiche. (G) Numero medio di ChAT+ LMN per sezione nel midollo spinale lombare; media, SEM e punti dati individuali mostrati per n = 5 repliche biologiche. ****p < .0001, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. (H) Numero medio di NeuN+/ChAT+ LMN (vulnerabili alla degenerazione) per sezione nel midollo spinale lombare; media, SEM e punti dati individuali mostrati per n = 5 repliche biologiche. ****p < .0001, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo post hoc di Tukey. (I) Numero medio di GFP+/ChAT+ LMN (resistenti alla degenerazione) per sezione nel midollo spinale lombare; media, SEM e punti dati individuali mostrati per n = 5 repliche biologiche
FIGURA 9 Dati comportamentali dei topi WT-UeGFP, hSOD1G93A-UeGFP e prpTDP-43A315T-UeGFP con o senza trattamento NU-9. I topi WT-UeGFP e hSOD1G93A-UeGFP sono stati testati ogni 7 giorni tra il giorno postnatale (P)60 e P120; I topi prpTDP-43A315T-UeGFP sono stati testati a P60, P90 e P120. (A) Peso dei topi in grammi. Media e SEM mostrati per n ≥ 5 topi per gruppo. WT-UeGFP (veicolo) rispetto a hSOD1G93A-UeGFP (veicolo); #p < .05, ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey. (B) Latenza di caduta durante l'accelerazione del rotarod in secondi. Media e SEM mostrati per n ≥ 5 topi per gruppo. WT-UeGFP (veicolo) rispetto a hSOD1G93A-UeGFP (veicolo). #p < .05, ##p < .01, ###p < .001, ####p < .0001, ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey. (C) Latenza per cadere a testa in giù da una griglia metallica in pochi secondi. Media e SEM mostrati per n ≥ 5 topi per gruppo. WT-UeGFP (veicolo) rispetto a hSOD1G93A-UeGFP (veicolo). #p < .05, ###p < .001, ####p < .0001; hSOD1G93A‐UeGFP (veicolo) rispetto a hSOD1G93A‐UeGFP (NU‐9 100 mg/kg/giorno). *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, ANOVA a due vie con test di confronto multiplo di Tukey. (D) Latenza di caduta durante l'accelerazione del rotarod in secondi. Media e SEM mostrati per n ≥ 4 topi per gruppo. WT-UeGFP (veicolo) rispetto a prpTDP-43A315T-UeGFP (veicolo). ##p < .01, ####p < .0001, Analisi degli effetti misti con il test di confronto multiplo di Tukey. (E) Latenza per cadere a testa in giù da una griglia metallica in pochi secondi. Media e SEM mostrati per n ≥ 3 topi per gruppo. WT-UeGFP (veicolo) rispetto a prpTDP-43A315T-UeGFP (veicolo), ####p < .0001; prpTDP-43A315T-UeGFP (non trattato) rispetto a prpTDP-43A315T-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/giorno), ****p < .0001, analisi degli effetti misti con il test di confronto multiplo di Tukey