Barış Genç et al. Clin Transl Med. 2021 februari
Bakgrund: Övre motorneuroner (UMN) är en nyckelkomponent i motorneuronkretsar. Deras degeneration är ett kännetecken för sjukdomar, såsom ärftlig spastisk paraplegi (HSP), primär lateral skleros (PLS) och amyotrofisk lateral skleros (ALS). För närvarande finns det inga prekliniska analyser som undersöker cellulära svar från UMN på sammansatt behandling, även för sjukdomar i UMN. Grunden för UMN-sårbarhet är inte helt klarlagd, och ingen substans har ännu identifierats för att förbättra hälsan hos sjuka UMN:två stora vägspärrar för att bygga effektiva behandlingsstrategier.
Metoder: Nya UMN-reportermodeller, där UMN:er som är sjuka på grund av felveckad superoxiddismutasprotein (mSOD1)-toxicitet och TDP-43-patologi är märkta med eGFP-uttryck, tillåter direkt bedömning av UMN-svar på föreningsbehandling. Elektronmikroskopi avslöjar mycket exakta aspekter av endoplasmatisk retikulum (ER) och mitokondriell skada. Administrering av NU-9, en förening som ursprungligen identifierades baserat på dess förmåga att minska mSOD1-toxicitet, har djupgående inverkan på att förbättra hälsan och stabiliteten hos UMN, vilket identifierats av detaljerade cellulära och ultrastrukturella analyser.
Resultat: Problem med mitokondrier och ER bevaras i sjuka UMN bland olika arter. NU-9 har läkemedelsliknande farmakokinetiska egenskaper. Det saknar toxicitet och passerar blod-hjärnbarriären. NU-9 förbättrar den strukturella integriteten av mitokondrier och ER, minskar nivåerna av mSOD1, stabiliserar degenererande UMN apikala dendriter, förbättrar motoriskt beteende mätt med hängtrådstestet och eliminerar pågående degeneration av UMN som blir sjuka både på grund av mSOD1 toxicitet och TDP-43 viktig orsak till neurotologi och TDP-43 degeneration.
Slutsatser: Mekanismfokuserade och cellbaserade läkemedelsupptäcktsstrategier tog inte bara upp viktiga cellulära defekter som är ansvariga för UMN-förlust, utan identifierade också NU-9, den första föreningen för att förbättra hälsan hos sjuka UMN, neuroner som degenererar hos ALS-, HSP-, PLS- och ALS/FTLD-patienter.
Sökord: ALS; HSP; NU-9; PLS; TDP-43 patologi; mSODl; övre motorneuroner.
© 2021 The Authors. Klinisk och translationell medicin publicerad av John Wiley &Sons Australia, Ltd på uppdrag av Shanghai Institute of Clinical Bioinformatics.
PubMed Ansvarsfriskrivning
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.
FIGUR 1 Övre motorneuroner (UMN) uppvisar ultrastrukturella defekter hos patienter med amyotrofisk lateral skleros (ALS) och i musmodeller som är sjuka på grund av olika bakomliggande orsaker. (A) Representativ elektronmikroskopisk (EM) bild av UMN av normal kontroll verkar intakt medan (B) UMN av ALS-patient visar cytoarkitekturiska defekter. (C) EM-bild av UMN av WT-mus. (D) Representativ EM-bild av UMN av hSOD1G93A och (E) prpTDP-43A315T-mus som visar massiv ultrastrukturell sönderdelning. (F) Mitokondrierna i en normal kontroll som visar intakta inre mitokondriella membran (pilar), i motsats till (G) mitokondrier hos ALS-patienter som visar sönderfall av inre mitokondriella membran (pilspetsar). (H) Mitokondrier i WT-mus verkar vara strukturellt intakta med distinkta inre och yttre mitokondriella membran (pil), medan (I) mitokondrier i UMN i en hSOD1G93A- och (J) prpTDP-43A315T-mus som uppvisar allvarlig mitokondriella sönderdelning av inre membran). (K) Elektronmikrofotografier av UMN endoplasmatiskt retikulum (ER) i en normal kontroll visar korrekt staplade långa cisterner (pilar), men (L) ER hos ALS-patient visar utvidgning och ballongbildning av ER-cisterner (pilspetsar). På liknande sätt ser (M) ER i en WT-mus (pilar) strukturellt intakt ut i motsats till (N) ER i UMN av hSOD1G93A och (O) prpTDP-43A315T-mus som visar trasiga, korta och sönderfallna ER-cisterner (pilspetsar). (P) Kvantifiering av genomsnittlig procentandel av ER med cytoarkitekturiska defekter/UMN hos ALS-patienter. ****p < .0001, Elevens t-test. (Q) Kvantifiering av genomsnittlig procentandel av ER med cytoarkitektoniska defekter/UMN i hSOD1G93A. ****p < .0001 och prpTDP-43A315T-möss. ****p < .0001, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc multiple-comparison test. (R) Kvantifiering av genomsnittlig längd av ER cisternae/UMN hos ALS-patienter. **p < .001, Elevens t-test. (S) Kvantifiering av genomsnittlig längd av ER-cisterner/UMN i hSOD1G93A ****p < .0001 och prpTDP-43A315T-möss. ****p < .0001, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc multiple-comparison test. Skalstaplar:A–E = 2 µm; F–O = 200 nm
FIGUR 2 NU-9-behandling förbättrar den ultrastrukturella integriteten av både mitokondrier och endoplasmatiskt retikulum (ER) hos övre motorneuroner (UMN) som blir sjuka av mutant SOD1-toxicitet. (A) Progression från träff till att leda till NU-9 med kemisk struktur av NU-9. (B) Experimentell design för in vivo-studier. (C–F) Representativa elektronmikroskopiska (EM) bilder av UMN i motorbarken hos WT-UeGFP-möss behandlade med fordon vid P120. Pilar pekar på mitokondrier med intakt innermembran och ER med intakta cisterner. Skalstaplar, C:2 µm; D–F:200 nm. (G-J) Representativa EM-bilder av UMN i motorbarken hos hSOD1G93A-UeGFP-möss behandlade med fordon vid P120. (G) Cytoplasman saknar mestadels viktiga nyckelorganeller, och (H) det finns många elektrontäta aggregat (pilspetsar) och stora droppar. (I) Mitokondrier som förlorat integriteten hos sitt inre membran (pilspets) eller har övergripande strukturella skador, och (J) fragmenterade delar av ER (pilspetsar) är uppenbara. Skalstaplar, G:2 µm; H–J:200 nm. (K–N) Representativa EM-bilder av UMN i den motoriska cortexen hos hSOD1G93A-UeGFP-möss behandlade med 100 mg/kg/dag NU-9. (K) Övergripande förbättring av cytoplasman med närvaron av många organeller. (L) Mitokondrier verkar vara friska (pilar), och cytoplasman saknar stora täta aggregat och droppar. (M) Integriteten hos det inre mitokondriella membranet och cristae-strukturen återställs (pilar), och (N) ER-cisterner (pilar) är ordnade i korrekt struktur utan någon fragmentering. Skalstaplar, I:2 µm; L–N:200 nm. (O) Kvantifiering av totalt antal mitokondrier/UMN i hSOD1G93A-UeGFP-möss med NU-9-behandling. **p < .006, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc multiple-jämförelsetest. (P) Kvantifiering av procent av friska mitokondrier/UMN i hSOD1G93A-UeGFP-möss med NU-9-behandling. ****p < .0001, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc multiple-comparison test. (Q) Kvantifiering av antalet ER-cisterner/UMN i hSOD1G93A-UeGFP-möss med NU-9-behandling. *p < .016, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för multipeljämförelse. (R) Kvantifiering av genomsnittlig längd av ER-cisternae/UMN i hSOD1G93A-UeGFP-möss med NU-9-behandling. **p < .002, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc multiple-comparison test
FIGUR 3 NU-9-behandling minskar felveckade SOD1-nivåer i övre motorneuroner (UMN) hos hSOD1G93A-UeGFP-möss. (A) Representativa bilder av UMN:er och B8H10-antikroppsfärgning som känner igen felveckat SOD1-protein i motorbarken hos WT‐UeGFP eller (B) hSOD1G93A‐UeGFP-möss behandlade med vehikel, (C) 20 mg/kg/dag NU-9, eller (D) 900 mg/dag. Skalstänger, 20 µm; n ≥ 3 biologiska replikat. (E) Genomsnittlig integrerad täthet av felveckad SOD1-fluorescens i UMNs i den motoriska cortexen hos WT-UeGFP- eller hSOD1G93A-UeGFP-möss behandlade med vehikel, 20 mg/kg/dag NU-9 eller 100 mg/kg/dag NU-9; medelvärde, SEM och individuella datapunkter visas för n ≥ 3 biologiska replikat. **p < .01, ****p < .0001, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc multipeljämförelsetest
FIGUR 4 NU-9-behandling förbättrar cytoarkitektonisk integritet för sönderfallande apikala dendriter av övre motorneuroner (UMN) som blir sjuka av felveckad SOD1-toxicitet. (A) Representativa bilder av UMN apikala dendriter i den motoriska cortexen hos WT-UeGFP eller (B) hSOD1G93A-UeGFP-möss behandlade med vehikel, (C) 20 mg/kg/dag NU-9, eller (D) 100 mg/kg/dag NU-9. Inramade ytor förstoras till höger och ytterligare exempel tillhandahålls. Skalstaplar:50 µm (låg mag), 10 µm (insatt hög mag); n ≥ 6 biologiska replikat. (E) Representativ bild av en frisk, intakt och (F) en sjuk, sönderfallande apikal dendrit. Skalstaplar:5 µm. (G) Genomsnittlig procentandel av UMN apikala dendriter med vakuoler per sektion i motorisk cortex; medelvärde, SEM och individuella datapunkter visas för n ≥ 6 biologiska replikat. *p < .05, **p < .01, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för flera jämförelser
FIGUR 5 NU-9-behandling minskar degeneration av övre motorneuron (UMN) av sjuka UMN till följd av felveckad SOD1-toxicitet in vivo. (A–D) Representativa bilder av UMN i den motoriska cortexen hos WT-UeGFP- eller hSOD1G93A-UeGFP-möss behandlade med fordon, 20 mg/kg/dag NU-9 eller 100 mg/kg/dag NU-9. Skalstaplar:50 µm; n ≥ 5 biologiska replikat. (E) Genomsnittligt antal UMN per sektion i den motoriska cortexen; medelvärde, SEM och individuella datapunkter visas för n ≥ 5 biologiska replikat. *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-multipeljämförelsetest
FIGUR 6 NU-9-behandling förbättrar den ultrastrukturella integriteten av både mitokondrier och endoplasmatiskt retikulum (ER) hos övre motorneuroner (UMN) som blir sjuka på grund av TDP-43-patologi. Mitokondriella och ER-defekter i UMN hos prpTDP-43A315T-UeGFP-möss har tidigare publicerats. (A–C) Representativa elektronmikroskopiska bilder av UMN:er av obehandlade prpTDP-43A315T-UeGFP-möss. (A) UMN soma, med få intakta organeller. (B) Mitokondrier förlorar integriteten hos sitt inre membran (pilspetsar), och (C) ER-cisterner sönderdelas och går sönder (pilspetsar). (D–F) Representativa elektronmikroskopiska bilder av UMN av prpTDP-43A315T-UeGFP-möss behandlade med 100 mg/kg/dag NU-9. (D) En övergripande förbättring av cytoarkitekturen är bevisad med korrekt kärnmembran, närvaro av många friska organeller och avsaknad av elektrontäta aggregat. (E) Mitokondrier verkar friska med förbättrat inre membran och cristae (pil) (F), och ER-cisterner arrangerade i rätt struktur med ribosomer bifogade (pilar). Skalstaplar:A,D:2 µm; B,C,E,F:200 nm. (G) Kvantifiering av det totala antalet mitokondrier/UMN i prpTDP-43A315T-UeGFP-möss med 100 mg/kg/dag NU-9-behandling; *p < .03. (H) Kvantifiering av procent av friska mitokondrier/UMN i prpTDP-43A315T-UeGFP-möss med 100 mg/kg/dag NU-9-behandling; ****p < .0001. (I) Kvantifiering av antalet ER-cisterner/UMN i prpTDP-43A315T-UeGFP-möss med 100 mg/kg/dag NU-9-behandling; ***p < .0003. (J) Kvantifiering av genomsnittlig längd av ER-cisternae/UMN i prpTDP-43A315T-UeGFP-möss med 100 mg/kg/dag NU-9-behandling; ****p < .0001. Envägs ANOVA följt av Tukeys post hoc multipeljämförelsetest användes för statistiska analyser
FIGUR 7 NU-9-behandling förbättrar den cytoarkitektoniska integriteten hos sönderfallande apikala dendriter och eliminerar progressiv degeneration av övre motorneuroner (UMN) som blir sjuka på grund av TDP-43-patologi. (A) Representativa bilder av UMN apikala dendriter i den motoriska cortexen hos obehandlade prpTDP-43A315T-UeGFP-möss och (B) prpTDP-43A315T-UeGFP-möss behandlade med 100 mg/kg/dag av NU-9. Inramad yta förstoras till höger med ytterligare representativa exempel. Skalstaplar:50 µm (låg mag), 10 µm (insatt hög mag); n ≥ 3 biologiska replikat. (C) Representativ bild av en frisk, intakt och (D) en sjuk, sönderfallande apikal dendrit. Skalstaplar:5 µm. (E) Genomsnittlig procentandel av apikala dendriter med vakuoler per sektionsarea i den motoriska cortexen; medelvärde, SEM och individuella datapunkter visas för n ≥ 3 biologiska replikat. **p < .01, ***p < .001, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-test för flera jämförelser. (F) Representativa bilder av UMN i den motoriska cortexen hos obehandlade prpTDP-43A315T-UeGFP-möss och (G) prpTDP-43A315T behandlade med 100 mg/kg/dag NU-9. Skalstaplar:50 µm; n ≥ 3 biologiska replikat. (H) Genomsnittligt antal UMN per sektionsområde i den motoriska cortexen; medelvärde, SEM och individuella datapunkter visas för n ≥ 3 biologiska replikat. *p < .05, **p < .01, ***p < .001, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc multiple-comparison test
FIGUR 8 NU-9-behandling förbättrar inte degenerering av lägre motorneuroner (LMN) till följd av felveckad SOD1-toxicitet in vivo. (A och B) Representativa bilder av LMN i ländryggmärgen på obehandlade prpTDP-43A315T-UeGFP-möss eller behandlade med 100 mg/kg/dag NU-9. Skalstång:50 µm; n ≥ 3 biologiska replikat. (C–F) Representativa bilder av LMN i ländryggmärgen på WT-UeGFP- eller hSOD1G93A-UeGFP-möss behandlade med vehikel, 20 mg/kg/dag NU-9 eller 100 mg/kg/dag NU-9. Skalstång:50 µm; n = 5 biologiska replikat. (G) Genomsnittligt antal ChAT+ LMN per sektion i ländryggmärgen; medelvärde, SEM och individuella datapunkter visas för n = 5 biologiska replikat. ****p < .0001, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc multiple-comparison test. (H) Genomsnittligt antal NeuN+/ChAT+ LMNs (sårbara för degeneration) per sektion i ländryggmärgen; medelvärde, SEM och individuella datapunkter visas för n = 5 biologiska replikat. ****p < .0001, enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc multiple-comparison test. (I) Genomsnittligt antal GFP+/ChAT+ LMN (resistenta mot degeneration) per sektion i ländryggmärgen; medelvärde, SEM och individuella datapunkter visas för n = 5 biologiska replikat
FIGUR 9 Beteendedata för WT-UeGFP-, hSOD1G93A-UeGFP och prpTDP-43A315T-UeGFP-möss med eller utan NU-9-behandling. WT-UeGFP- och hSOD1G93A-UeGFP-möss testades var 7:e dag mellan postnatal dag (P)60 och P120; prpTDP-43A315T-UeGFP-möss testades vid P60, P90 och P120. (A) Vikten av mössen i gram. Medelvärde och SEM visas för n ≥ 5 möss per grupp. WT‐UeGFP (fordon) kontra hSOD1G93A‐UeGFP (fordon); #p < .05, tvåvägs ANOVA med Tukeys multipeljämförelsetest. (B) Latens för att falla på accelererande rotarod i sekunder. Medelvärde och SEM visas för n ≥ 5 möss per grupp. WT‐UeGFP (fordon) kontra hSOD1G93A‐UeGFP (fordon). #p < .05, ##p < .01, ###p < .001, ####p < .0001, Tvåvägs ANOVA med Tukeys multipeljämförelsetest. (C) Fallfördröjning hänger upp och ner från ett trådnät på några sekunder. Medelvärde och SEM visas för n ≥ 5 möss per grupp. WT‐UeGFP (fordon) kontra hSOD1G93A‐UeGFP (fordon). #p < .05, ###p < .001, ####p < .0001; hSOD1G93A-UeGFP (fordon) kontra hSOD1G93A-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/dag). *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, Tvåvägs ANOVA med Tukeys multipeljämförelsetest. (D) Latens för att falla på accelererande rotarod i sekunder. Medelvärde och SEM visas för n ≥ 4 möss per grupp. WT‐UeGFP (fordon) kontra prpTDP‐43A315T‐UeGFP (fordon). ##p < .01, ####p < .0001, Analys av blandade effekter med Tukeys multipeljämförelsetest. (E) Fallfördröjning hänger upp och ner från ett trådnät på några sekunder. Medelvärde och SEM visas för n ≥ 3 möss per grupp. WT‐UeGFP (fordon) kontra prpTDP‐43A315T‐UeGFP (fordon), ####p < .0001; prpTDP-43A315T-UeGFP (obehandlad) kontra prpTDP-43A315T-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/dag), ****p < .0001, blandad-effektanalys med Tukeys multipeljämförelsetest