Barış Genç a spol. Clin Transl Med. Február 2021
Pozadie: Horné motorické neuróny (UMN) sú kľúčovou zložkou obvodov motorických neurónov. Ich degenerácia je charakteristickým znakom chorôb, ako je dedičná spastická paraplégia (HSP), primárna laterálna skleróza (PLS) a amyotrofická laterálna skleróza (ALS). V súčasnosti neexistujú žiadne predklinické testy skúmajúce bunkové odpovede UMN na liečbu zlúčeninou, dokonca ani na choroby UMN. Základ zraniteľnosti UMN nie je úplne pochopený a zatiaľ nebola identifikovaná žiadna zlúčenina, ktorá by zlepšila zdravie chorých UMN:dve hlavné prekážky pri budovaní účinných liečebných stratégií.
Metódy: Nové reportérske modely UMN, v ktorých sú UMN, ktoré sú choré kvôli toxicite nesprávne zloženého proteínu superoxiddismutázy (mSOD1) a patológii TDP-43, označené expresiou eGFP, umožňujú priame hodnotenie odpovede UMN na liečbu zlúčeninou. Elektrónová mikroskopia odhaľuje veľmi presné aspekty poškodenia endoplazmatického retikula (ER) a mitochondrií. Podávanie NU-9, zlúčeniny, ktorá bola pôvodne identifikovaná na základe jej schopnosti znižovať toxicitu mSOD1, má hlboký vplyv na zlepšenie zdravia a stability UMN, ako bolo identifikované podrobnými bunkovými a ultraštrukturálnymi analýzami.
Výsledky: Problémy s mitochondriami a ER sú zachované u chorých UMN medzi rôznymi druhmi. NU-9 má farmakokinetické vlastnosti podobné liekom. Chýba mu toxicita a prechádza hematoencefalickou bariérou. NU-9 zlepšuje štrukturálnu integritu mitochondrií a ER, znižuje hladiny mSOD1, stabilizuje degenerujúce apikálne dendrity UMN, zlepšuje motorické správanie merané testom visiaceho drôtu a eliminuje pokračujúcu degeneráciu UMN, ktoré sa ochorejú z dôvodu toxicity mSOD1 a patológie TDP-43, dvoch odlišných a dôležitých všeobecných príčin degenerácie motorických neurónov.
Závery: Prístupy zamerané na mechanizmus a na bunkách založené na objavovaní liekov sa nezaoberali len kľúčovými bunkovými defektmi zodpovednými za stratu UMN, ale identifikovali aj NU-9, prvú zlúčeninu na zlepšenie zdravia chorých UMN, neurónov, ktoré degenerujú u pacientov s ALS, HSP, PLS a ALS/FTLD.
Kľúčové slová: ALS; HSP; NU-9; PLS; patológia TDP-43; mSOD1; horné motorické neuróny.
© 2021 Autori. Klinická a translačná medicína publikovaná spoločnosťou John Wiley &Sons Australia, Ltd v mene Šanghajského inštitútu klinickej bioinformatiky.
Vyhlásenie PubMed
Autori vyhlasujú, že neexistuje konflikt záujmov.
OBRÁZOK 1 Horné motorické neuróny (UMN) vykazujú ultraštrukturálne defekty u pacientov s amyotrofickou laterálnou sklerózou (ALS) a u myších modelov, ktoré sú choré v dôsledku rôznych základných príčin. (A) Reprezentatívny elektrónový mikroskop (EM) obraz UMN normálnej kontroly sa javí nedotknutý, zatiaľ čo (B) UMN pacienta s ALS vykazuje cytoarchitektonické defekty. (C) EM obraz UMN myši WT. (D) Reprezentatívny EM obraz UMN hSOD1G93A a (E) myš prpTDP-43A315T vykazujúca masívnu ultraštrukturálnu dezintegráciu. (F) Mitochondrie v normálnej kontrole ukazujúce neporušené vnútorné mitochondriálne membrány (šípky), na rozdiel od (G) mitochondrií u pacienta s ALS, ktorý vykazuje rozpad vnútornej mitochondriálnej membrány (šípky). (H) Mitochondrie u myši WT sa javia ako štrukturálne neporušené s odlišnými vnútornými a vonkajšími mitochondriálnymi membránami (šípka), zatiaľ čo (I) mitochondrie v UMN u myši hSOD1G93A a (J) prpTDP-43A315T vykazujúce vážnu dezintegráciu vnútorných mitochondriálnych membrán (šípky). (K) Elektrónové mikrofotografie UMN endoplazmatického retikula (ER) v normálnom kontrolnom zobrazení správne naskladaných dlhých cisterien (šípky), ale (L) ER u pacienta s ALS ukazuje distenziu a nafukovanie ER cisterien (šípky). Podobne (M) ER v myši WT (šípky) vyzerá štrukturálne neporušene na rozdiel od (N) ER v UMN myši hSOD1G93A a (O) prpTDP-43A315T, ktorá vykazuje zlomené, krátke a rozpadnuté cisterny ER (šípky). (P) Kvantifikácia priemerného percenta ER s cytoarchitektonickými defektmi/UMN u pacientov s ALS. ****p < .0001, Študentov t-test. (Q) Kvantifikácia priemerného percenta ER s cytoarchitektonickými defektmi/UMN v hSOD1G93A. ****p < .0001 a myši prpTDP-43A315T. ****p < .0001, Jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test. (R) Kvantifikácia priemernej dĺžky ER cisterien/UMN u pacientov s ALS. **p < .001, Študentov t-test. (S) Kvantifikácia priemernej dĺžky ER cisterien/UMN u myší hSOD1G93A **** p < .0001 a prpTDP-43A315T. ****p < .0001, Jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test. Mierka:A–E = 2 µm; F–O = 200 nm
OBRÁZOK 2 Liečba NU-9 zlepšuje ultraštrukturálnu integritu mitochondrií aj endoplazmatického retikula (ER) horných motorických neurónov (UMN), ktoré ochorejú na mutantnú toxicitu SOD1. (A) Postup od zásahu k vede k NU-9 s chemickou štruktúrou NU-9. (B) Experimentálny dizajn pre štúdie in vivo. (C – F) Reprezentatívne elektrónové mikroskopické (EM) snímky UMN v motorickej kôre WT-UeGFP myší liečených vehikulom pri P120. Šípky ukazujú na mitochondrie s neporušenou vnútornou membránou a ER s neporušenými cisternami. Mierka, C:2 µm; D-F:200 nm. (G–J) Reprezentatívne EM snímky UMN v motorickej kôre hSOD1G93A-UeGFP myší liečených vehikulom pri P120. (G) Cytoplazma je väčšinou bez hlavných kľúčových organel a (H) sú tu početné elektrónové husté agregáty (šípky) a veľké kvapôčky. (I) Mitochondrie, ktoré stratili integritu svojej vnútornej membrány (hrot šípky) alebo majú celkové štrukturálne poškodenie, a (J) fragmentované kúsky ER (hroty šípky). Mierka, G:2 µm; H–J:200 nm. (K–N) Reprezentatívne EM snímky UMN v motorickej kôre hSOD1G93A-UeGFP myší liečených 100 mg/kg/deň NU-9. (K) Celkové zlepšenie v cytoplazme s prítomnosťou početných organel. (L) Mitochondrie sa zdajú byť zdravé (šípky) a v cytoplazme chýbajú veľké husté agregáty a kvapôčky. (M) Integrita vnútornej mitochondriálnej membrány a štruktúry krís je obnovená (šípky) a (N) ER cisterny (šípky) sú usporiadané v správnej štruktúre bez akejkoľvek fragmentácie. Mierka, I:2 µm; L–N:200 nm. (O) Kvantifikácia celkového počtu mitochondrií / UMN u myší hSOD1G93A-UeGFP s liečbou NU-9. **p < .006, jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test. (P) Kvantifikácia percenta zdravých mitochondrií / UMN u myší hSOD1G93A-UeGFP s liečbou NU-9. ****p < .0001, Jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test. (Q) Kvantifikácia počtu ER cisterien/UMN u myší hSOD1G93A-UeGFP s liečbou NU-9. *p < .016, Jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test. (R) Kvantifikácia priemernej dĺžky ER cisterien / UMN u myší hSOD1G93A-UeGFP s liečbou NU-9. **p < .002, jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test
OBRÁZOK 3 Liečba NU-9 znižuje nesprávne zložené hladiny SOD1 v horných motorických neurónoch (UMN) myší hSOD1G93A-UeGFP. (A) Reprezentatívne obrázky farbenia UMN a protilátky B8H10, ktoré rozpoznáva nesprávne poskladaný proteín SOD1 v motorickej kôre WT-UeGFP alebo (B) myší hSOD1G93A-UeGFP liečených vehikulom, (C) 20 mg/kg/deň NU‐9 alebo (9mg/deň) 10 Mierka, 20 µm; n ≥ 3 biologické replikácie. (E) Priemerná integrovaná hustota zle zloženej fluorescencie SOD1 v UMN v motorickej kôre myší WT-UeGFP alebo hSOD1G93A-UeGFP liečených vehikulom, 20 mg/kg/deň NU-9 alebo 100 mg/kg/deň NU-9; priemer, SEM a jednotlivé dátové body zobrazené pre n ≥ 3 biologických replikátov. **p < .01, ****p < .0001, jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test
OBRÁZOK 4 Liečba NU-9 zlepšuje cytoarchitektonickú integritu rozpadajúcich sa apikálnych dendritov horných motorických neurónov (UMN), ktoré ochorejú v dôsledku nesprávne poskladanej toxicity SOD1. (A) Reprezentatívne snímky apikálnych dendritov UMN v motorickej kôre WT-UeGFP alebo (B) myší hSOD1G93A-UeGFP liečených vehikulom, (C) 20 mg/kg/deň NU‐9 alebo (D) 100 mg/kg/deň NU‐9. Oblasti v rámčekoch sú zväčšené doprava a dodávajú sa ďalšie príklady. Mierka:50 µm (nízke mag.), 10 µm (vysoká mag. vložka); n ≥ 6 biologických replikátov. (E) Reprezentatívny obraz zdravého, neporušeného a (F) chorého, rozpadajúceho sa apikálneho dendritu. Mierka:5 µm. (G) Priemerné percento apikálnych dendritov UMN s vakuolami na sekciu v motorickej kôre; priemer, SEM a jednotlivé dátové body zobrazené pre n ≥ 6 biologických replikátov. *p < .05, **p < .01, jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test
OBRÁZOK 5 Liečba NU-9 znižuje degeneráciu horných motorických neurónov (UMN) chorých UMN v dôsledku nesprávne poskladanej toxicity SOD1 in vivo. (A–D) Reprezentatívne snímky UMN v motorickej kôre WT-UeGFP alebo hSOD1G93A-UeGFP myší liečených vehikulom, 20 mg/kg/deň NU-9 alebo 100 mg/kg/deň NU‐9. Mierka:50 µm; n ≥ 5 biologických replikátov. (E) Priemerný počet UMN na sekciu v motorickej kôre; priemer, SEM a jednotlivé dátové body zobrazené pre n ≥ 5 biologických replikátov. *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, Jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test
OBRÁZOK 6 Liečba NU‐9 zlepšuje ultraštrukturálnu integritu mitochondrií aj endoplazmatického retikula (ER) horných motorických neurónov (UMN), ktoré ochorejú v dôsledku patológie TDP-43. Mitochondriálne a ER defekty v UMN myší prpTDP-43A315T-UeGFP boli predtým publikované. (A – C) Reprezentatívne elektrónové mikroskopické snímky UMN neošetrených myší prpTDP-43A315T-UeGFP. (A) UMN soma s niekoľkými neporušenými organelami. (B) Mitochondrie strácajú integritu svojej vnútornej membrány (šípky) a (C) ER cisterny sú dezintegrované a zlomené (šípky). (D–F) Reprezentatívne elektrónové mikroskopické snímky UMN myší prpTDP-43A315T-UeGFP liečených 100 mg/kg/deň NU-9. (D) Celkové zlepšenie v cytoarchitektúre je dokázané správnou jadrovou membránou, prítomnosťou mnohých zdravých organel a nedostatkom agregátov s hustotou elektrónov. (E) Mitochondrie sa zdajú byť zdravé so zlepšenou vnútornou membránou a kristami (šípka) (F) a ER cisterny usporiadané do správnej štruktúry s pripojenými ribozómami (šípky). Mierka:A, D:2 µm; B, C, E, F:200 nm. (G) Kvantifikácia celkového počtu mitochondrií/UMN u myší prpTDP‐43A315T‐UeGFP s liečbou NU‐9 100 mg/kg/deň; *p< .03. (H) Kvantifikácia percenta zdravých mitochondrií/UMN u myší prpTDP‐43A315T‐UeGFP s liečbou NU‐9 100 mg/kg/deň; ****p < .0001. (I) Kvantifikácia počtu ER cisterien/UMN u myší prpTDP‐43A315T‐UeGFP s liečbou NU‐9 dávkou 100 mg/kg/deň; ***p<.0003. (J) Kvantifikácia priemernej dĺžky ER cisterien/UMN u myší prpTDP‐43A315T‐UeGFP s liečbou NU‐9 dávkou 100 mg/kg/deň; ****p < .0001. Na štatistické analýzy sa použila jednosmerná ANOVA nasledovaná Tukeyho post hoc viacnásobným porovnávacím testom
OBRÁZOK 7 Liečba NU‐9 zlepšuje cytoarchitektonickú integritu rozpadajúcich sa apikálnych dendritov a eliminuje progresívnu degeneráciu horných motorických neurónov (UMN), ktoré ochorejú v dôsledku patológie TDP-43. (A) Reprezentatívne snímky apikálnych dendritov UMN v motorickej kôre neliečených myší prpTDP-43A315T-UeGFP a (B) myší prpTDP-43A315T-UeGFP liečených 100 mg/kg/deň NU-9. Oblasť v rámčeku je zväčšená doprava s ďalšími reprezentatívnymi príkladmi. Mierka:50 µm (nízke mag.), 10 µm (vysoká mag. vložka); n ≥ 3 biologické replikácie. (C) Reprezentatívny obraz zdravého, neporušeného a (D) chorého, rozpadajúceho sa apikálneho dendritu. Mierka:5 µm. (E) Priemerné percento apikálnych dendritov s vakuolami na plochu rezu v motorickej kôre; priemer, SEM a jednotlivé dátové body zobrazené pre n ≥ 3 biologických replikátov. **p < .01, ***p < .001, jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test. (F) Reprezentatívne snímky UMN v motorickej kôre neliečených myší prpTDP-43A315T-UeGFP a (G) prpTDP-43A315T liečených 100 mg/kg/deň NU‐9. Mierka:50 µm; n ≥ 3 biologické replikácie. (H) Priemerný počet UMN na oblasť sekcie v motorickej kôre; priemer, SEM a jednotlivé dátové body zobrazené pre n ≥ 3 biologických replikátov. *p < .05, **p < .01, ***p < .001, Jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test
OBRÁZOK 8 Liečba NU-9 nezlepšuje degeneráciu dolných motorických neurónov (LMN) v dôsledku nesprávne zloženej toxicity SOD1 in vivo. (A a B) Reprezentatívne snímky LMN v lumbálnej mieche neliečených myší prpTDP-43A315T-UeGFP alebo liečených 100 mg/kg/deň NU-9. Mierka:50 µm; n ≥ 3 biologické replikácie. (C – F) Reprezentatívne snímky LMN v lumbálnej mieche myší WT-UeGFP alebo hSOD1G93A-UeGFP liečených vehikulom, 20 mg/kg/deň NU-9 alebo 100 mg/kg/deň NU-9. Mierka:50 µm; n = 5 biologických replikátov. (G) Priemerný počet ChAT+ LMN na sekciu v driekovej mieche; priemer, SEM a jednotlivé dátové body zobrazené pre n = 5 biologických replikátov. ****p < .0001, Jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test. (H) Priemerný počet NeuN+/ChAT+ LMN (zraniteľných voči degenerácii) na sekciu v driekovej mieche; priemer, SEM a jednotlivé dátové body zobrazené pre n = 5 biologických replikátov. ****p < .0001, Jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc viacnásobný porovnávací test. (I) Priemerný počet GFP+/ChAT+ LMN (odolných voči degenerácii) na sekciu v driekovej mieche; priemer, SEM a jednotlivé dátové body zobrazené pre n = 5 biologických replikátov
OBRÁZOK 9 Údaje o správaní myší WT-UeGFP, hSOD1G93A-UeGFP a prpTDP-43A315T-UeGFP s liečbou NU-9 alebo bez nej. Myši WT‐UeGFP a hSOD1G93A‐UeGFP boli testované každých 7 dní medzi postnatálnym dňom (P)60 a P120; Myši prpTDP-43A315T-UeGFP boli testované na P60, P90 a P120. (A) Hmotnosť myší v gramoch. Priemer a SEM zobrazené pre n ≥ 5 myší na skupinu. WT‐UeGFP (vozidlo) verzus hSOD1G93A‐UeGFP (vozidlo); #p < 0,05, obojsmerná ANOVA s Tukeyho viacnásobným porovnávacím testom. (B) Latencia pádu na zrýchľujúcu rotarod v sekundách. Priemer a SEM zobrazené pre n ≥ 5 myší na skupinu. WT‐UeGFP (vozidlo) verzus hSOD1G93A‐UeGFP (vozidlo). #p < .05, ##p < .01, ###p < .001, ####p < .0001, Dvojcestná ANOVA s Tukeyho viacnásobným porovnávacím testom. (C) Latencia pádu visiaca hore nohami z drôtenej mriežky za pár sekúnd. Priemer a SEM zobrazené pre n ≥ 5 myší na skupinu. WT‐UeGFP (vozidlo) verzus hSOD1G93A‐UeGFP (vozidlo). #p < .05, ###p < .001, ####p < .0001; hSOD1G93A-UeGFP (vozidlo) verzus hSOD1G93A-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/deň). *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, Obojsmerná ANOVA s Tukeyho viacnásobným porovnávacím testom. (D) Latencia pádu na zrýchľujúci rotarod v sekundách. Priemer a SEM zobrazené pre n ≥ 4 myši na skupinu. WT-UeGFP (vozidlo) verzus prpTDP-43A315T-UeGFP (vozidlo). ##p < .01, ####p < .0001, Analýza zmiešaných účinkov s Tukeyho viacnásobným porovnávacím testom. (E) Latencia pádu visiaca hore nohami z drôtenej mriežky za pár sekúnd. Priemer a SEM zobrazené pre n ≥ 3 myši na skupinu. WT‐UeGFP (vozidlo) verzus prpTDP‐43A315T‐UeGFP (vozidlo), ####p < .0001; prpTDP‐43A315T‐UeGFP (neliečené) verzus prpTDP‐43A315T‐UeGFP (NU‐9 100 mg/kg/deň), ****p < .0001, analýza zmiešaných účinkov s Tukeyho mnohonásobným porovnaním