Barış Genç dkk. Klinik Terjemahan Med. Februari 2021
Latar belakang: Neuron motorik atas (UMN) adalah komponen kunci dari sirkuit neuron motorik. Degenerasinya merupakan ciri khas penyakit, seperti paraplegia spastik herediter (HSP), sklerosis lateral primer (PLS), dan sklerosis lateral amyotrophic (ALS). Saat ini tidak ada uji praklinis yang menyelidiki respons seluler UMN terhadap pengobatan gabungan, bahkan untuk penyakit UMN. Dasar kerentanan UMN belum sepenuhnya dipahami, dan belum ada senyawa yang teridentifikasi untuk meningkatkan kesehatan UMN yang sakit:dua hambatan utama dalam membangun strategi pengobatan yang efektif.
Metode: Model reporter UMN baru, di mana UMN yang sakit karena toksisitas protein superoksida dismutase (mSOD1) yang salah lipatan dan patologi TDP-43 diberi label dengan ekspresi eGFP, memungkinkan penilaian langsung respons UMN terhadap pengobatan senyawa. Mikroskop elektron mengungkapkan aspek yang sangat tepat dari retikulum endoplasma (ER) dan kerusakan mitokondria. Pemberian NU-9, suatu senyawa yang awalnya diidentifikasi berdasarkan kemampuannya untuk mengurangi toksisitas mSOD1, memiliki dampak besar pada peningkatan kesehatan dan stabilitas UMN, sebagaimana diidentifikasi melalui analisis seluler dan ultrastruktural yang terperinci.
Hasil: Masalah dengan mitokondria dan ER tetap ada pada UMN yang sakit di antara spesies yang berbeda. NU-9 memiliki sifat farmakokinetik seperti obat. Ia tidak memiliki toksisitas dan melintasi sawar darah otak. NU-9 meningkatkan integritas struktural mitokondria dan ER, mengurangi kadar mSOD1, menstabilkan degenerasi dendrit apikal UMN, meningkatkan perilaku motorik yang diukur dengan uji kawat gantung, dan menghilangkan degenerasi UMN yang sedang berlangsung yang menjadi sakit karena toksisitas mSOD1 dan patologi TDP-43, dua penyebab utama degenerasi neuron motorik yang berbeda dan penting.
Kesimpulan: Pendekatan penemuan obat yang berfokus pada mekanisme dan berbasis sel tidak hanya mengatasi kerusakan seluler utama yang menyebabkan hilangnya UMN, namun juga mengidentifikasi NU-9, senyawa pertama yang meningkatkan kesehatan UMN yang sakit, neuron yang mengalami degenerasi pada pasien ALS, HSP, PLS, dan ALS/FTLD.
Kata kunci: ALS; HSP; NU-9; Tolong; Patologi TDP-43; mSOD1; neuron motorik atas.
© 2021 Penulis. Kedokteran Klinis dan Translasi diterbitkan oleh John Wiley &Sons Australia, Ltd atas nama Institut Bioinformatika Klinis Shanghai.
Penafian PubMed
Penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.
GAMBAR 1 Neuron motorik atas (UMN) menunjukkan cacat ultrastruktural pada pasien amyotrophic lateral sclerosis (ALS), dan pada model tikus yang sakit karena penyebab mendasar yang berbeda. (A) Gambar mikroskopis elektron (EM) representatif dari UMN kontrol normal tampak utuh sementara (B) UMN pasien ALS menunjukkan cacat sitoarsitektur. (C) Gambar EM UMN mouse WT. (D) Gambar EM representatif dari UMN hSOD1G93A, dan (E) mouse prpTDP‐43A315T menampilkan disintegrasi ultrastruktural yang masif. (F) Mitokondria pada kontrol normal menunjukkan membran dalam mitokondria yang utuh (panah), dibandingkan dengan (G) mitokondria pada pasien ALS yang menunjukkan disintegrasi membran dalam mitokondria (panah). (H) Mitokondria pada tikus WT tampaknya utuh secara struktural dengan membran mitokondria dalam dan luar yang berbeda (panah), sedangkan (I) mitokondria pada UMN pada tikus hSOD1G93A dan (J) prpTDP-43A315T menunjukkan disintegrasi parah pada membran mitokondria bagian dalam (panah). (K) Mikrograf elektron retikulum endoplasma (ER) UMN pada kontrol normal menampilkan sisterna panjang yang bertumpuk dengan baik (panah), namun (L) ER pada pasien ALS menunjukkan distensi dan penggelembungan sisterna ER (kepala panah). Demikian pula, (M) ER pada mouse WT (panah) terlihat utuh secara struktural berbeda dengan (N) ER di UMN hSOD1G93A dan (O) prpTDP‐43A315T mouse yang menampilkan sisterna ER yang rusak, pendek, dan hancur (panah). (P) Kuantifikasi persentase rata-rata ER dengan cacat sitoarsitektur/UMN pada pasien ALS. ****p< .0001, uji-t Siswa. (Q) Kuantifikasi persentase rata-rata ER dengan cacat sitoarsitektur/UMN di hSOD1G93A. ****p< .0001, dan tikus prpTDP‐43A315T. ****p < .0001, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey. (R) Kuantifikasi rata-rata panjang ER sisterna/UMN pada pasien ALS. **p< 0,001, uji-t Siswa. (S) Kuantifikasi panjang rata-rata ER cisternae/UMN pada tikus hSOD1G93A **** p < .0001, dan prpTDP‐43A315T. ****p < .0001, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey. Bilah skala:A–E = 2 µm; F–O = 200 nm
GAMBAR 2 Pengobatan NU-9 meningkatkan integritas ultrastruktur mitokondria dan retikulum endoplasma (ER) neuron motorik atas (UMN) yang terkena penyakit akibat toksisitas SOD1 mutan. (A) Perkembangan dari pukulan menjadi NU-9 dengan struktur kimia NU-9. (B) Desain eksperimental untuk studi in vivo. (C – F) Gambar mikroskopis elektron (EM) representatif dari UMN di korteks motorik tikus WT-UeGFP yang diobati dengan kendaraan di P120. Panah menunjuk ke mitokondria dengan membran dalam yang utuh dan RE dengan sisterna yang utuh. Bilah skala, C:2 µm; D–F:200 nm. (G – J) Gambar EM representatif dari UMN di korteks motorik tikus hSOD1G93A ‐ UeGFP yang diobati dengan kendaraan di P120. (G) Sitoplasma sebagian besar tidak memiliki organel utama, dan (H) terdapat banyak agregat padat elektron (panah) dan tetesan besar. (I) Mitokondria yang kehilangan integritas membran bagian dalamnya (panah) atau mengalami kerusakan struktural secara keseluruhan, dan (J) potongan RE yang terfragmentasi (panah) terlihat jelas. Bilah skala, G:2 µm; H–J:200 nm. (K – N) Gambar EM representatif dari UMN di korteks motorik tikus hSOD1G93A ‐ UeGFP yang diobati dengan 100 mg/kg/hari NU-9. (K) Peningkatan sitoplasma secara keseluruhan dengan hadirnya banyak organel. (Kiri) Mitokondria tampak sehat (panah), dan sitoplasmanya tidak memiliki agregat dan tetesan padat yang besar. (M) Integritas membran dalam mitokondria dan struktur krista dipulihkan (panah), dan (N) sisterna ER (panah) disusun dalam struktur yang tepat tanpa fragmentasi apa pun. Bilah skala, I:2 µm; Panjang–T:200 nm. (O) Kuantifikasi jumlah total mitokondria/UMN pada tikus hSOD1G93A‐UeGFP dengan pengobatan NU‐9. **p < .006, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey. (P) Kuantifikasi persentase mitokondria/UMN sehat pada tikus hSOD1G93A‐UeGFP dengan pengobatan NU‐9. ****p < .0001, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey. (Q) Kuantifikasi jumlah ER cisternae/UMN pada tikus hSOD1G93A‐UeGFP dengan pengobatan NU‐9. *p< .016, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey. (R) Kuantifikasi panjang rata-rata ER cisternae/UMN pada tikus hSOD1G93A‐UeGFP dengan pengobatan NU‐9. **p < .002, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey
GAMBAR 3 Pengobatan NU-9 mengurangi kadar SOD1 yang salah lipat pada neuron motorik atas (UMN) tikus hSOD1G93A-UeGFP. (A) Gambar representatif pewarnaan antibodi UMN dan B8H10 yang mengenali protein SOD1 yang salah lipatan di korteks motorik WT-UeGFP atau (B) tikus hSOD1G93A-UeGFP yang diobati dengan kendaraan, (C) 20 mg/kg/hari NU-9, atau (D) 100 mg/kg/hari NU-9. Skala bar, 20 µm; n ≥ 3 ulangan biologis. (E) Kepadatan terintegrasi rata-rata dari fluoresensi SOD1 yang salah lipatan pada UMN di korteks motorik tikus WT-UeGFP atau hSOD1G93A-UeGFP yang diobati dengan kendaraan, 20 mg/kg/hari NU-9, atau 100 mg/kg/hari NU-9; mean, SEM, dan titik data individual ditampilkan untuk n ≥ 3 ulangan biologis. **p < .01, ****p < .0001, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey
GAMBAR 4 Pengobatan NU-9 meningkatkan integritas sitoarsitektur dari disintegrasi dendrit apikal dari neuron motorik atas (UMN) yang menjadi sakit karena toksisitas SOD1 yang salah lipatan. (A) Gambar representatif dendrit apikal UMN di korteks motorik WT-UeGFP atau (B) tikus hSOD1G93A-UeGFP yang diobati dengan kendaraan, (C) 20 mg/kg/hari NU-9, atau (D) 100 mg/kg/hari NU-9. Area kotak diperbesar ke kanan dan contoh tambahan disediakan. Bilah skala:50 µm (mag rendah), 10 µm (inset mag tinggi); n ≥ 6 ulangan biologis. (E) Gambaran representatif dari dendrit apikal yang sehat, utuh, dan (F) yang sakit dan hancur. Bilah skala:5 µm. (G) Persentase rata-rata dendrit apikal UMN dengan vakuola per bagian di korteks motorik; mean, SEM, dan titik data individu ditampilkan untuk n ≥ 6 ulangan biologis. *p < .05, **p < .01, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey
GAMBAR 5 Pengobatan NU-9 mengurangi degenerasi neuron motorik atas (UMN) pada penyakit UMN akibat kesalahan toksisitas SOD1 in vivo. (A – D) Gambar representatif UMN di korteks motorik tikus WT-UeGFP atau hSOD1G93A-UeGFP yang diobati dengan kendaraan, 20 mg/kg/hari NU-9, atau 100 mg/kg/hari NU-9. Bilah skala:50 µm; n ≥ 5 ulangan biologis. (E) Jumlah rata-rata UMN per bagian di korteks motorik; mean, SEM, dan titik data individu ditampilkan untuk n ≥ 5 ulangan biologis. *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey
GAMBAR 6
Pengobatan NU-9 meningkatkan integritas ultrastruktur mitokondria dan retikulum endoplasma (ER) neuron motorik atas (UMN) yang menjadi sakit karena patologi TDP-43. Cacat mitokondria dan ER pada UMN tikus prpTDP-43A315T-UeGFP telah dipublikasikan sebelumnya. (A – C) Gambar mikroskopis elektron representatif dari UMN tikus prpTDP‐43A315T‐UeGFP yang tidak diobati. (A) Soma UMN, dengan sedikit organel utuh. (B) Mitokondria kehilangan integritas membran bagian dalamnya (panah), dan (C) sisterna ER hancur dan pecah (panah). (D – F) Gambar mikroskopis elektron representatif dari UMN tikus prpTDP‐43A315T‐UeGFP yang diberi 100 mg/kg/hari NU-9. (D) Peningkatan keseluruhan dalam sitoarsitektur dibuktikan dengan membran inti yang tepat, adanya banyak organel yang sehat, dan kurangnya agregat padat elektron. (E) Mitokondria tampak sehat dengan membran dalam dan krista yang lebih baik (panah) (F), dan sisterna ER tersusun dalam struktur yang tepat dengan ribosom terpasang (panah). Bilah skala:A,D:2 µm; B,C,E,F:200 nm. (G) Kuantifikasi jumlah total mitokondria/UMN pada tikus prpTDP‐43A315T‐UeGFP dengan pengobatan NU-9 100 mg/kg/hari; *p< .03. (H) Kuantifikasi persentase mitokondria/UMN sehat pada tikus prpTDP‐43A315T‐UeGFP dengan pengobatan NU‐9 100 mg/kg/hari; ****p< .0001. (I) Kuantifikasi jumlah ER cisternae/UMN pada tikus prpTDP‐43A315T‐UeGFP dengan pengobatan NU-9 100 mg/kg/hari; ***p< .0003. (J) Kuantifikasi rata-rata panjang ER cisternae/UMN pada tikus prpTDP‐43A315T‐UeGFP dengan pengobatan NU‐9 100 mg/kg/hari; ****p< .0001. ANOVA satu arah yang diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey digunakan untuk analisis statistik. 
GAMBAR 7
Pengobatan NU-9 meningkatkan integritas sitoarsitektur dendrit apikal yang hancur dan menghilangkan degenerasi progresif neuron motorik atas (UMN) yang menjadi sakit akibat patologi TDP-43. (A) Gambar representatif dendrit apikal UMN di korteks motorik tikus prpTDP-43A315T-UeGFP yang tidak diobati dan (B) tikus prpTDP-43A315T-UeGFP yang diobati dengan NU-9 100 mg/kg/hari. Area kotak diperbesar ke kanan dengan contoh tambahan yang representatif. Bilah skala:50 µm (mag rendah), 10 µm (inset mag tinggi); n ≥ 3 ulangan biologis. (C) Gambaran representatif dari dendrit apikal yang sehat, utuh, dan (D) yang sakit dan hancur. Bilah skala:5 µm. (E) Persentase rata-rata dendrit apikal dengan vakuola per luas bagian di korteks motorik; mean, SEM, dan titik data individual ditampilkan untuk n ≥ 3 ulangan biologis. **p < .01, ***p < .001, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey. (F) Gambar representatif UMN di korteks motorik tikus prpTDP‐43A315T‐UeGFP yang tidak diobati dan (G) prpTDP‐43A315T yang diobati dengan NU-9 100 mg/kg/hari. Bilah skala:50 µm; n ≥ 3 ulangan biologis. (H) Jumlah rata-rata UMN per area bagian di korteks motorik; mean, SEM, dan titik data individual ditampilkan untuk n ≥ 3 ulangan biologis. *p < .05, **p < .01, ***p < .001, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey
GAMBAR 8 Pengobatan NU-9 tidak memperbaiki degenerasi neuron motorik bawah (LMN) akibat kesalahan toksisitas SOD1 in vivo. (A dan B) Gambar representatif LMN di sumsum tulang belakang lumbal tikus prpTDP‐43A315T‐UeGFP yang tidak diobati atau diobati dengan NU-9 100 mg/kg/hari. Bilah skala:50 µm; n ≥ 3 ulangan biologis. (C – F) Gambar representatif LMN di sumsum tulang belakang lumbal tikus WT-UeGFP atau hSOD1G93A-UeGFP yang diobati dengan kendaraan, 20 mg/kg/hari NU-9, atau 100 mg/kg/hari NU-9. Bilah skala:50 µm; n = 5 ulangan biologis. (G) Jumlah rata-rata ChAT+ LMN per bagian di sumsum tulang belakang lumbal; mean, SEM, dan titik data individual ditampilkan untuk n = 5 ulangan biologis. ****p < .0001, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey. (H) Jumlah rata-rata LMN NeuN+/ChAT+ (rentan terhadap degenerasi) per bagian di sumsum tulang belakang lumbal; mean, SEM, dan titik data individual ditampilkan untuk n = 5 ulangan biologis. ****p < .0001, ANOVA satu arah diikuti dengan uji perbandingan berganda post hoc Tukey. (I) Jumlah rata-rata LMN GFP+/ChAT+ (resisten terhadap degenerasi) per bagian di sumsum tulang belakang lumbal; mean, SEM, dan titik data individual ditampilkan untuk n = 5 ulangan biologis
GAMBAR 9 Data perilaku tikus WT-UeGFP, hSOD1G93A-UeGFP, dan prpTDP-43A315T-UeGFP dengan atau tanpa pengobatan NU-9. Tikus WT-UeGFP dan hSOD1G93A-UeGFP diuji setiap 7 hari antara hari pascakelahiran (P)60 dan P120; Tikus prpTDP‐43A315T‐UeGFP diuji pada P60, P90, dan P120. (A) Berat tikus dalam gram. Rata-rata dan SEM ditampilkan untuk n ≥ 5 tikus per kelompok. WT-UeGFP (kendaraan) versus hSOD1G93A-UeGFP (kendaraan); #p < .05, ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Tukey. (B) Latensi turun saat mempercepat rotarod dalam hitungan detik. Rata-rata dan SEM ditampilkan untuk n ≥ 5 tikus per kelompok. WT-UeGFP (kendaraan) versus hSOD1G93A-UeGFP (kendaraan). #p < .05, ##p < .01, ###p < .001, ####p < .0001, ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Tukey. (C) Latensi jatuh tergantung terbalik dari jaringan kawat dalam hitungan detik. Rata-rata dan SEM ditampilkan untuk n ≥ 5 tikus per kelompok. WT-UeGFP (kendaraan) versus hSOD1G93A-UeGFP (kendaraan). #p < .05, ###p < .001, ####p < .0001; hSOD1G93A‐UeGFP (kendaraan) versus hSOD1G93A‐UeGFP (NU‐9 100 mg/kg/hari). *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, ANOVA dua arah dengan uji perbandingan berganda Tukey. (D) Latensi turun saat mempercepat rotarod dalam hitungan detik. Rata-rata dan SEM ditampilkan untuk n ≥ 4 tikus per kelompok. WT-UeGFP (kendaraan) versus prpTDP-43A315T-UeGFP (kendaraan). ##p < .01, ####p < .0001, Analisis efek campuran dengan uji perbandingan berganda Tukey. (E) Latensi jatuh tergantung terbalik dari jaringan kawat dalam hitungan detik. Rata-rata dan SEM ditampilkan untuk n ≥ 3 tikus per kelompok. WT‐UeGFP (kendaraan) versus prpTDP‐43A315T‐UeGFP (kendaraan), ####p < .0001; prpTDP‐43A315T-UeGFP (tidak diobati) versus prpTDP‐43A315T-UeGFP (NU‐9 100 mg/kg/hari), ****p < .0001, analisis efek campuran dengan uji perbandingan berganda Tukey