Barış Genç et al. Clin Transl Med. Février 2021
Contexte : Les motoneurones supérieurs (UMN) sont un élément clé des circuits des motoneurones. Leur dégénérescence est une caractéristique de maladies telles que la paraplégie spastique héréditaire (HSP), la sclérose latérale primaire (PLS) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Il n’existe actuellement aucun test préclinique étudiant les réponses cellulaires des UMN à un traitement composé, même pour les maladies des UMN. Les fondements de la vulnérabilité des UMN ne sont pas entièrement compris et aucun composé n’a encore été identifié pour améliorer la santé des UMN malades :deux obstacles majeurs à l’élaboration de stratégies de traitement efficaces.
Méthodes : De nouveaux modèles de rapporteurs UMN, dans lesquels les UMN malades en raison de la toxicité de la protéine superoxyde dismutase (mSOD1) mal repliée et de la pathologie TDP-43 sont marqués avec l'expression de l'eGFP, permettent une évaluation directe de la réponse de l'UMN au traitement composé. La microscopie électronique révèle des aspects très précis du réticulum endoplasmique (RE) et des lésions mitochondriales. L'administration de NU-9, un composé initialement identifié sur la base de sa capacité à réduire la toxicité de la mSOD1, a un impact profond sur l'amélioration de la santé et de la stabilité des UMN, comme l'ont identifié des analyses cellulaires et ultrastructurales détaillées.
Résultats : Les problèmes liés aux mitochondries et aux ER sont conservés dans les UMN malades parmi différentes espèces. Le NU-9 possède des propriétés pharmacocinétiques comparables à celles d’un médicament. Il manque de toxicité et traverse la barrière hémato-encéphalique. NU-9 améliore l'intégrité structurelle des mitochondries et des ER, réduit les niveaux de mSOD1, stabilise les dendrites apicales dégénératives de l'UMN, améliore le comportement moteur mesuré par le test du fil suspendu et élimine la dégénérescence continue des UMN qui deviennent malades à la fois en raison de la toxicité de la mSOD1 et de la pathologie du TDP-43, deux causes principales distinctes et importantes de la dégénérescence des motoneurones.
Conclusions : Les approches de découverte de médicaments axées sur les mécanismes et basées sur les cellules ont non seulement abordé les défauts cellulaires clés responsables de la perte d'UMN, mais ont également identifié NU-9, le premier composé à améliorer la santé des UMN malades, des neurones qui dégénèrent chez les patients SLA, HSP, PLS et SLA/FTLD.
Mots clés : SLA ; PSH ; NU-9 ; SVP ; Pathologie TDP-43 ; mSOD1 ; motoneurones supérieurs.
© 2021 Les auteurs. Médecine clinique et translationnelle publié par John Wiley &Sons Australia, Ltd pour le compte de l'Institut de bioinformatique clinique de Shanghai.
Avis de non-responsabilité PubMed
Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflit d'intérêts.
FIGURE 1 Les motoneurones supérieurs (UMN) présentent des défauts ultrastructuraux chez les patients atteints de sclérose latérale amyotrophique (SLA) et chez les modèles murins malades en raison de différentes causes sous-jacentes. (A) L’image représentative au microscope électronique (EM) de l’UMN de contrôle normal apparaît intacte tandis que (B) l’UMN du patient SLA présente des défauts cytoarchitecturaux. (C) Image EM de l’UMN de la souris WT. (D) Image EM représentative de l’UMN de hSOD1G93A et (E) souris prpTDP-43A315T présentant une désintégration ultrastructurale massive. (F) Les mitochondries dans un contrôle normal montrant des membranes mitochondriales internes intactes (flèches), par opposition aux mitochondries (G) chez un patient SLA qui présentent une désintégration de la membrane mitochondriale interne (pointes de flèches). (H) Les mitochondries chez la souris WT semblent être structurellement intactes avec des membranes mitochondriales internes et externes distinctes (flèche), tandis que (I) les mitochondries dans l'UMN dans une souris hSOD1G93A et (J) prpTDP-43A315T présentent une désintégration sévère des membranes mitochondriales internes (pointes de flèches). (K) Les micrographies électroniques du réticulum endoplasmique (ER) de l'UMN dans un contrôle normal affichent de longues citernes correctement empilées (flèches), mais (L) ER chez un patient SLA montre une distension et un ballonnement des citernes ER (têtes de flèches). De même, (M) ER chez une souris WT (flèches) semble structurellement intact contrairement à (N) ER dans l'UMN de hSOD1G93A et (O) prpTDP-43A315T qui présente des citernes ER cassées, courtes et désintégrées (pointes de flèches). (P) Quantification du pourcentage moyen de RE présentant des défauts cytoarchitecturaux/UMN chez les patients SLA. ****p < .0001, test t de Student. (Q) Quantification du pourcentage moyen d’ER avec des défauts cytoarchitecturaux/UMN dans hSOD1G93A. ****p < 0,0001 et souris prpTDP‐43A315T. ****p < 0001, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey. (R) Quantification de la longueur moyenne des citernes ER/UMN chez les patients SLA. **p < 0,001, test t de Student. (S) Quantification de la longueur moyenne des citernes ER/UMN chez les souris hSOD1G93A **** p < 0,0001 et prpTDP-43A315T. ****p < 0001, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey. Barres d'échelle : A–E = 2 µm ; F–O = 200 nm
FIGURE 2 Le traitement NU‐9 améliore l'intégrité ultrastructurale des mitochondries et du réticulum endoplasmique (RE) des motoneurones supérieurs (UMN) qui deviennent malades à cause de la toxicité de la SOD1 mutante. (A) Progression depuis le coup jusqu'à conduire à NU-9 avec la structure chimique de NU-9. (B) Conception expérimentale pour les études in vivo. (C – F) Images représentatives au microscope électronique (EM) des UMN dans le cortex moteur de souris WT‐UeGFP traitées avec le véhicule à P120. Les flèches pointent vers les mitochondries avec une membrane interne intacte et le RE avec des citernes intactes. Barres d'échelle, C : 2 µm ; D–F :200 nm. (G – J) Images EM représentatives des UMN dans le cortex moteur de souris hSOD1G93A-UeGFP traitées avec le véhicule à P120. (G) Le cytoplasme est pour la plupart dépourvu d’organites clés majeurs, et (H) il existe de nombreux agrégats denses en électrons (pointes de flèches) et de grosses gouttelettes. (I) Les mitochondries qui ont perdu l'intégrité de leur membrane interne (pointe de flèche) ou présentent des dommages structurels globaux, et (J) des morceaux fragmentés du RE (pointes de flèche) sont évidents. Barres d'échelle, G : 2 µm ; H–J :200 nm. (K – N) Images EM représentatives des UMN dans le cortex moteur de souris hSOD1G93A-UeGFP traitées avec 100 mg/kg/jour de NU-9. (K) Amélioration globale du cytoplasme avec présence de nombreux organites. (L) Les mitochondries semblent saines (flèches) et le cytoplasme manque d’agrégats et de gouttelettes denses majeurs. (M) L’intégrité de la membrane mitochondriale interne et de la structure des crêtes est restaurée (flèches), et (N) les citernes ER (flèches) sont disposées selon une structure appropriée sans aucune fragmentation. Barres d'échelle, I :2 µm ; L-N :200 nm. (O) Quantification du nombre total de mitochondries/UMN chez les souris hSOD1G93A-UeGFP avec traitement NU-9. **p < 0,006, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey. (P) Quantification du pourcentage de mitochondries/UMN saines chez les souris hSOD1G93A-UeGFP avec traitement NU-9. ****p < 0001, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey. (Q) Quantification du nombre de citernes ER/UMN chez les souris hSOD1G93A-UeGFP avec traitement NU-9. *p < 0,016, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey. (R) Quantification de la longueur moyenne des citernes ER/UMN chez les souris hSOD1G93A-UeGFP avec traitement NU-9. **p < 002, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey
FIGURE 3 Le traitement NU‐9 réduit les niveaux de SOD1 mal repliés dans les motoneurones supérieurs (UMN) des souris hSOD1G93A‐UeGFP. (A) Images représentatives des UMN et de la coloration des anticorps B8H10 qui reconnaissent la protéine SOD1 mal repliée dans le cortex moteur de WT-UeGFP ou (B) des souris hSOD1G93A-UeGFP traitées avec le véhicule, (C) 20 mg/kg/jour de NU-9 ou (D) 100 mg/kg/jour de NU-9. Barres d'échelle, 20 µm ; n ≥ 3 répétitions biologiques. (E) Densité intégrée moyenne de fluorescence SOD1 mal repliée dans les UMN du cortex moteur de souris WT-UeGFP ou hSOD1G93A-UeGFP traitées avec un véhicule, 20 mg/kg/jour de NU-9 ou 100 mg/kg/jour de NU-9 ; points de données moyens, SEM et individuels affichés pour n ≥ 3 répétitions biologiques. **p < .01, ****p < .0001, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey
FIGURE 4 Le traitement NU‐9 améliore l'intégrité cytoarchitecturale des dendrites apicales en désintégration des motoneurones supérieurs (UMN) qui deviennent malades à cause d'une toxicité SOD1 mal repliée. (A) Images représentatives des dendrites apicales UMN dans le cortex moteur de souris WT-UeGFP ou (B) hSOD1G93A-UeGFP traitées avec le véhicule, (C) 20 mg/kg/jour NU-9 ou (D) 100 mg/kg/jour NU-9. Les zones encadrées sont agrandies vers la droite et des exemples supplémentaires sont fournis. Barres d'échelle :50 µm (faible mag), 10 µm (encart haute mag) ; n ≥ 6 répétitions biologiques. (E) Image représentative d’une dendrite apicale saine, intacte et (F) d’une dendrite apicale malade et en désintégration. Barres d'échelle :5 µm. (G) Pourcentage moyen de dendrites apicales UMN avec vacuoles par section dans le cortex moteur ; points de données moyens, SEM et individuels affichés pour n ≥ 6 répétitions biologiques. *p < 0,05, **p < 0,01, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey
FIGURE 5 Le traitement NU‐9 réduit la dégénérescence des motoneurones supérieurs (UMN) des UMN malades résultant d'une toxicité SOD1 mal repliée in vivo. (A – D) Images représentatives des UMN dans le cortex moteur de souris WT-UeGFP ou hSOD1G93A-UeGFP traitées avec un véhicule, 20 mg/kg/jour de NU-9 ou 100 mg/kg/jour de NU-9. Barres d'échelle : 50 µm ; n ≥ 5 répétitions biologiques. (E) Nombre moyen d’UMN par section dans le cortex moteur ; points de données moyens, SEM et individuels affichés pour n ≥ 5 répétitions biologiques. *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey
FIGURE 6 Le traitement NU‐9 améliore l'intégrité ultrastructurale des mitochondries et du réticulum endoplasmique (RE) des motoneurones supérieurs (UMN) qui deviennent malades en raison de la pathologie TDP‐43. Des défauts mitochondriaux et ER dans les UMN des souris prpTDP-43A315T-UeGFP ont déjà été publiés. (A – C) Images représentatives au microscope électronique d’UMN de souris prpTDP‐43A315T‐UeGFP non traitées. (A) Soma UMN, avec quelques organites intacts. (B) Les mitochondries perdent l’intégrité de leur membrane interne (pointes de flèches) et (C) les citernes du RE sont désintégrées et brisées (pointes de flèches). (D – F) Images représentatives au microscope électronique des UMN de souris prpTDP‐43A315T‐UeGFP traitées avec 100 mg/kg/jour de NU-9. (D) Une amélioration globale de la cytoarchitecture est mise en évidence par une membrane nucléaire appropriée, la présence de nombreux organites sains et l’absence d’agrégats denses en électrons. (E) Les mitochondries semblent saines avec une membrane interne et des crêtes améliorées (flèche) (F) et des citernes ER disposées selon une structure appropriée avec des ribosomes attachés (flèches). Barres d'échelle : A,D :2 µm ; B, C, E, F :200 nm. (G) Quantification du nombre total de mitochondries/UMN chez les souris prpTDP-43A315T-UeGFP avec 100 mg/kg/jour de traitement NU-9 ; *p < .03. (H) Quantification du pourcentage de mitochondries/UMN saines chez les souris prpTDP-43A315T-UeGFP avec 100 mg/kg/jour de traitement NU-9 ; ****p < .0001. (I) Quantification du nombre de citernes ER/UMN chez les souris prpTDP-43A315T-UeGFP avec 100 mg/kg/jour de traitement NU-9 ; ***p < .0003. (J) Quantification de la longueur moyenne des citernes ER/UMN chez les souris prpTDP-43A315T-UeGFP avec 100 mg/kg/jour de traitement NU-9 ; ****p < .0001. Une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey a été utilisée pour les analyses statistiques
FIGURE 7 Le traitement NU-9 améliore l'intégrité cytoarchitecturale des dendrites apicales en désintégration et élimine la dégénérescence progressive des motoneurones supérieurs (UMN) qui deviennent malades en raison de la pathologie TDP-43. (A) Images représentatives des dendrites apicales UMN dans le cortex moteur de souris prpTDP-43A315T-UeGFP non traitées et (B) de souris prpTDP-43A315T-UeGFP traitées avec 100 mg/kg/jour de NU-9. La zone encadrée est agrandie vers la droite avec des exemples représentatifs supplémentaires. Barres d'échelle :50 µm (faible mag), 10 µm (encart haute mag) ; n ≥ 3 répétitions biologiques. (C) Image représentative d’une dendrite apicale saine, intacte et (D) d’une dendrite apicale malade et en désintégration. Barres d'échelle :5 µm. (E) Pourcentage moyen de dendrites apicales avec vacuoles par zone de section dans le cortex moteur ; points de données moyens, SEM et individuels affichés pour n ≥ 3 répétitions biologiques. **p < 0,01, ***p < 0,001, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey. (F) Images représentatives des UMN dans le cortex moteur de souris prpTDP-43A315T-UeGFP non traitées et (G) prpTDP-43A315T traitées avec 100 mg/kg/jour de NU-9. Barres d'échelle : 50 µm ; n ≥ 3 répétitions biologiques. (H) Nombre moyen d’UMN par zone de section dans le cortex moteur ; points de données moyens, SEM et individuels affichés pour n ≥ 3 répétitions biologiques. *p < .05, **p < .01, ***p < .001, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey
FIGURE 8 Le traitement NU‐9 n'améliore pas la dégénérescence des motoneurones inférieurs (LMN) résultant d'une toxicité SOD1 mal repliée in vivo. (A et B) Images représentatives des LMN dans la moelle épinière lombaire de souris prpTDP-43A315T-UeGFP non traitées ou traitées avec 100 mg/kg/jour de NU-9. Barre d'échelle : 50 µm ; n ≥ 3 répétitions biologiques. (C – F) Images représentatives des LMN dans la moelle épinière lombaire de souris WT-UeGFP ou hSOD1G93A-UeGFP traitées avec un véhicule, 20 mg/kg/jour de NU-9 ou 100 mg/kg/jour de NU-9. Barre d'échelle : 50 µm ; n = 5 répétitions biologiques. (G) Nombre moyen de ChAT+ LMN par section dans la moelle épinière lombaire ; moyenne, SEM et points de données individuels affichés pour n = 5 répétitions biologiques. ****p < 0001, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey. (H) Nombre moyen de LMN NeuN+/ChAT+ (vulnérables à la dégénérescence) par section dans la moelle épinière lombaire ; moyenne, SEM et points de données individuels affichés pour n = 5 répétitions biologiques. ****p < 0001, ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey. (I) Nombre moyen de LMN GFP+/ChAT+ (résistants à la dégénérescence) par section dans la moelle épinière lombaire ; moyenne, SEM et points de données individuels affichés pour n = 5 répétitions biologiques
FIGURE 9 Données comportementales de souris WT-UeGFP, hSOD1G93A-UeGFP et prpTDP-43A315T-UeGFP avec ou sans traitement NU-9. Les souris WT‐UeGFP et hSOD1G93A‐UeGFP ont été testées tous les 7 jours entre le jour postnatal (P)60 et P120 ; Les souris prpTDP-43A315T-UeGFP ont été testées à P60, P90 et P120. (A) Poids des souris en grammes. Moyenne et SEM indiqués pour n ≥ 5 souris par groupe. WT‐UeGFP (véhicule) versus hSOD1G93A‐UeGFP (véhicule) ; #p < 0,05, ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Tukey. (B) Latence de chute lors de l'accélération de la tige rotative en secondes. Moyenne et SEM indiqués pour n ≥ 5 souris par groupe. WT‐UeGFP (véhicule) versus hSOD1G93A‐UeGFP (véhicule). #p < .05, ##p < .01, ###p < .001, ####p < .0001, ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Tukey. (C) Latence pour tomber suspendu la tête en bas à un grillage en quelques secondes. Moyenne et SEM indiqués pour n ≥ 5 souris par groupe. WT‐UeGFP (véhicule) versus hSOD1G93A‐UeGFP (véhicule). #p < .05, ###p < .001, ####p < .0001 ; hSOD1G93A-UeGFP (véhicule) versus hSOD1G93A-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/jour). *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Tukey. (D) Latence de chute lors de l'accélération de la tige rotative en secondes. Moyenne et SEM indiqués pour n ≥ 4 souris par groupe. WT‐UeGFP (véhicule) versus prpTDP‐43A315T‐UeGFP (véhicule). ##p < .01, ####p < .0001, Analyse à effets mixtes avec le test de comparaison multiple de Tukey. (E) Latence pour tomber suspendu la tête en bas à un grillage en quelques secondes. Moyenne et SEM indiqués pour n ≥ 3 souris par groupe. WT‐UeGFP (véhicule) versus prpTDP‐43A315T‐UeGFP (véhicule), ####p < 0001 ; prpTDP‐43A315T‐UeGFP (non traité) versus prpTDP‐43A315T‐UeGFP (NU‐9 100 mg/kg/jour), ****p < 0,0001, analyse à effets mixtes avec le test de comparaison multiple de Tukey