Barış Genç et al. Clin Transl Med. Februar 2021
Hintergrund: Obere Motoneuronen (UMNs) sind eine Schlüsselkomponente der Schaltkreise der Motoneuronen. Ihre Degeneration ist ein Kennzeichen für Krankheiten wie die hereditäre spastische Paraplegie (HSP), die primäre Lateralsklerose (PLS) und die amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Derzeit gibt es keine präklinischen Tests, die die zellulären Reaktionen von UMNs auf die Behandlung mit Wirkstoffen untersuchen, auch nicht bei Erkrankungen der UMNs. Die Grundlage der UMN-Anfälligkeit ist nicht vollständig geklärt, und es wurde noch kein Wirkstoff identifiziert, der die Gesundheit erkrankter UMNs verbessern könnte:zwei große Hindernisse für die Entwicklung wirksamer Behandlungsstrategien.
Methoden: Neuartige UMN-Reportermodelle, in denen UMNs, die aufgrund der Toxizität des fehlgefalteten Superoxiddismutase-Proteins (mSOD1) und der TDP-43-Pathologie erkrankt sind, mit der eGFP-Expression markiert werden, ermöglichen eine direkte Bewertung der UMN-Reaktion auf die Behandlung mit Verbindungen. Die Elektronenmikroskopie deckt sehr genaue Aspekte des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der mitochondrialen Schädigung auf. Die Verabreichung von NU-9, einer Verbindung, die ursprünglich aufgrund ihrer Fähigkeit zur Reduzierung der mSOD1-Toxizität identifiziert wurde, hat tiefgreifende Auswirkungen auf die Verbesserung der Gesundheit und Stabilität von UMNs, wie durch detaillierte Zell- und Ultrastrukturanalysen festgestellt wurde.
Ergebnisse: Probleme mit Mitochondrien und ER bleiben bei erkrankten UMNs verschiedener Arten erhalten. NU-9 hat arzneimittelähnliche pharmakokinetische Eigenschaften. Es ist nicht toxisch und durchdringt die Blut-Hirn-Schranke. NU-9 verbessert die strukturelle Integrität von Mitochondrien und ER, reduziert den mSOD1-Spiegel, stabilisiert degenerierende UMN-apikale Dendriten, verbessert das mit dem Hängedrahttest gemessene motorische Verhalten und eliminiert die anhaltende Degeneration von UMNs, die sowohl aufgrund der mSOD1-Toxizität als auch der TDP-43-Pathologie erkranken, zwei verschiedene und wichtige übergreifende Ursachen für die Degeneration von Motoneuronen.
Schlussfolgerungen: Mechanismenfokussierte und zellbasierte Wirkstoffforschungsansätze befassten sich nicht nur mit wichtigen Zelldefekten, die für den UMN-Verlust verantwortlich sind, sondern identifizierten auch NU-9, die erste Verbindung, die die Gesundheit erkrankter UMNs verbessert, Neuronen, die bei ALS-, HSP-, PLS- und ALS/FTLD-Patienten degenerieren.
Schlüsselwörter: ALS; HSP; NU-9; PLS; TDP-43-Pathologie; mSOD1; obere Motoneuronen.
© 2021 Die Autoren. Klinische und translationale Medizin, herausgegeben von John Wiley &Sons Australia, Ltd im Auftrag des Shanghai Institute of Clinical Bioinformatics.
PubMed-Haftungsausschluss
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
ABBILDUNG 1 Obere Motoneuronen (UMNs) weisen bei Patienten mit Amyotropher Lateralsklerose (ALS) und in Mausmodellen, die aufgrund verschiedener zugrunde liegender Ursachen erkrankt sind, ultrastrukturelle Defekte auf. (A) Repräsentatives elektronenmikroskopisches (EM) Bild des UMN einer normalen Kontrolle scheint intakt zu sein, während (B) das UMN eines ALS-Patienten zytoarchitektonische Defekte aufweist. (C) EM-Bild des UMN der WT-Maus. (D) Repräsentatives EM-Bild des UMN von hSOD1G93A und (E) prpTDP-43A315T-Maus, das einen massiven ultrastrukturellen Zerfall zeigt. (F) Die Mitochondrien in einer normalen Kontrolle zeigen intakte innere Mitochondrienmembranen (Pfeile), im Gegensatz zu (G) Mitochondrien bei ALS-Patienten, die einen Zerfall der inneren Mitochondrienmembranen zeigen (Pfeilspitzen). (H) Mitochondrien in WT-Mäusen scheinen strukturell intakt zu sein mit unterschiedlichen inneren und äußeren Mitochondrienmembranen (Pfeil), wohingegen (I) Mitochondrien in UMN in einer hSOD1G93A- und (J) prpTDP-43A315T-Maus einen starken Zerfall der inneren Mitochondrienmembranen zeigen (Pfeilspitzen). (K) Elektronenmikroskopische Aufnahmen des endoplasmatischen Retikulums (ER) von UMN in einer normalen Kontrollgruppe zeigen ordnungsgemäß gestapelte lange Zisternen (Pfeile), aber (L) ER bei einem ALS-Patienten zeigt eine Ausdehnung und Ballonbildung der ER-Zisternen (Pfeilspitzen). In ähnlicher Weise sieht (M) ER in einer WT-Maus (Pfeile) strukturell intakt aus, im Gegensatz zu (N) ER im UMN von hSOD1G93A- und (O) prpTDP-43A315T-Mäusen, die gebrochene, kurze und zerfallene ER-Zisternen aufweisen (Pfeilspitzen). (P) Quantifizierung des durchschnittlichen Prozentsatzes von ER mit zytoarchitektonischen Defekten/UMN bei ALS-Patienten. ****p < .0001, Student-T-Test. (Q) Quantifizierung des durchschnittlichen Prozentsatzes von ER mit zytoarchitektonischen Defekten/UMN in hSOD1G93A. ****p < .0001 und prpTDP-43A315T-Mäuse. ****p < .0001, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. (R) Quantifizierung der durchschnittlichen Länge der ER-Zisternen/UMN bei ALS-Patienten. **p < .001, Student-t-Test. (S) Quantifizierung der durchschnittlichen Länge von ER-Zisternen/UMN in hSOD1G93A **** p < .0001 und prpTDP-43A315T-Mäusen. ****p < .0001, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. Maßstabsbalken:A–E = 2 µm; F–O = 200 nm
ABBILDUNG 2 Die Behandlung mit NU‐9 verbessert die ultrastrukturelle Integrität sowohl der Mitochondrien als auch des endoplasmatischen Retikulums (ER) der oberen Motoneuronen (UMNs), die durch mutierte SOD1-Toxizität erkranken. (A) Fortschritt vom Treffer zum Blei zu NU-9 mit der chemischen Struktur von NU-9. (B) Experimentelles Design für In-vivo-Studien. (C–F) Repräsentative elektronenmikroskopische (EM) Bilder von UMNs im motorischen Kortex von WT-UeGFP-Mäusen, die bei P120 mit Vehikel behandelt wurden. Die Pfeile zeigen auf Mitochondrien mit intakter Innenmembran und auf ER mit intakten Zisternen. Maßstabsbalken, C:2 µm; D–F:200 nm. (G–J) Repräsentative EM-Bilder von UMNs im motorischen Kortex von hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen, die bei P120 mit Vehikel behandelt wurden. (G) Das Zytoplasma ist größtenteils frei von wichtigen Schlüsselorganellen und (H) es gibt zahlreiche elektronendichte Aggregate (Pfeilspitzen) und große Tröpfchen. (I) Mitochondrien, die die Integrität ihrer inneren Membran verloren haben (Pfeilspitze) oder insgesamt strukturelle Schäden aufweisen, und (J) fragmentierte Teile des ER (Pfeilspitzen) sind erkennbar. Maßstabsbalken, G:2 µm; H–J:200 nm. (K–N) Repräsentative EM-Bilder von UMNs im motorischen Kortex von hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen, die mit 100 mg/kg/Tag NU-9 behandelt wurden. (K) Gesamtverbesserung des Zytoplasmas bei Vorhandensein zahlreicher Organellen. (L) Mitochondrien scheinen gesund zu sein (Pfeile), und dem Zytoplasma fehlen große dichte Aggregate und Tröpfchen. (M) Die Integrität der inneren Mitochondrienmembran und der Cristae-Struktur ist wiederhergestellt (Pfeile), und (N) ER-Zisternen (Pfeile) sind in der richtigen Struktur ohne Fragmentierung angeordnet. Maßstabsbalken, I:2 µm; L–N:200 nm. (O) Quantifizierung der Gesamtzahl der Mitochondrien/UMN in hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen mit NU-9-Behandlung. **p < .006, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. (P) Quantifizierung des Prozentsatzes gesunder Mitochondrien/UMN in hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen mit NU-9-Behandlung. ****p < .0001, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. (Q) Quantifizierung der Anzahl der ER-Zisternen/UMN in hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen mit NU-9-Behandlung. *p < .016, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. (R) Quantifizierung der durchschnittlichen Länge von ER-Zisternen/UMN in hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen mit NU-9-Behandlung. **p < .002, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest
ABBILDUNG 3 Die Behandlung mit NU-9 reduziert fehlgefaltete SOD1-Spiegel in oberen Motoneuronen (UMNs) von hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen. (A) Repräsentative Bilder von UMNs und B8H10-Antikörperfärbung, die fehlgefaltetes SOD1-Protein im motorischen Kortex von WT-UeGFP oder (B) hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen erkennt, die mit Vehikel behandelt wurden, (C) 20 mg/kg/Tag NU-9 oder (D) 100 mg/kg/Tag NU-9. Maßstabsbalken, 20 µm; n ≥ 3 biologische Replikate. (E) Durchschnittliche integrierte Dichte fehlgefalteter SOD1-Fluoreszenz in UMNs im motorischen Kortex von WT-UeGFP- oder hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen, behandelt mit Vehikel, 20 mg/kg/Tag NU-9 oder 100 mg/kg/Tag NU-9; Mittelwert, Standardabweichung und einzelne Datenpunkte für n ≥ 3 biologische Replikate. **p < .01, ****p < .0001, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest
ABBILDUNG 4 Die Behandlung mit NU‐9 verbessert die zytoarchitektonische Integrität zerfallender apikaler Dendriten oberer Motoneuronen (UMNs), die durch fehlgefaltete SOD1-Toxizität erkranken. (A) Repräsentative Bilder von UMN-apikalen Dendriten im motorischen Kortex von WT-UeGFP oder (B) hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen, behandelt mit Vehikel, (C) 20 mg/kg/Tag NU-9 oder (D) 100 mg/kg/Tag NU-9. Die eingerahmten Bereiche sind rechts vergrößert und es werden zusätzliche Beispiele bereitgestellt. Maßstabsbalken:50 µm (geringe Vergrößerung), 10 µm (Einschub mit hoher Vergrößerung); n ≥ 6 biologische Replikate. (E) Repräsentatives Bild eines gesunden, intakten und (F) eines erkrankten, zerfallenden apikalen Dendriten. Maßstabsbalken:5 µm. (G) Durchschnittlicher Prozentsatz der UMN-apikalen Dendriten mit Vakuolen pro Abschnitt im motorischen Kortex; Mittelwert, Standardabweichung und einzelne Datenpunkte für n ≥ 6 biologische Replikate. *p < .05, **p < .01, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest
ABBILDUNG 5 Die Behandlung mit NU‐9 verringert die Degeneration der oberen Motoneuronen (UMN) erkrankter UMNs, die auf eine fehlgefaltete SOD1-Toxizität in vivo zurückzuführen ist. (A–D) Repräsentative Bilder von UMNs im motorischen Kortex von WT-UeGFP- oder hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen, die mit Vehikel, 20 mg/kg/Tag NU-9 oder 100 mg/kg/Tag NU-9 behandelt wurden. Maßstabsbalken:50 µm; n ≥ 5 biologische Replikate. (E) Durchschnittliche Anzahl von UMNs pro Abschnitt im motorischen Kortex; Mittelwert, Standardabweichung und einzelne Datenpunkte für n ≥ 5 biologische Replikate. *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest
ABBILDUNG 6 Die Behandlung mit NU-9 verbessert die ultrastrukturelle Integrität sowohl der Mitochondrien als auch des endoplasmatischen Retikulums (ER) der oberen Motoneuronen (UMNs), die aufgrund der TDP-43-Pathologie erkranken. Mitochondriale und ER-Defekte in den UMNs von prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen wurden bereits veröffentlicht. (A–C) Repräsentative elektronenmikroskopische Bilder von UMNs unbehandelter prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäuse. (A) UMN-Soma mit wenigen intakten Organellen. (B) Mitochondrien verlieren die Integrität ihrer inneren Membran (Pfeilspitzen) und (C) ER-Zisternen sind zerfallen und gebrochen (Pfeilspitzen). (D–F) Repräsentative elektronenmikroskopische Bilder von UMNs von prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen, die mit 100 mg/kg/Tag NU-9 behandelt wurden. (D) Eine allgemeine Verbesserung der Zytoarchitektur wird durch eine ordnungsgemäße Kernmembran, das Vorhandensein zahlreicher gesunder Organellen und das Fehlen elektronendichter Aggregate nachgewiesen. (E) Mitochondrien erscheinen gesund mit verbesserter Innenmembran und Cristae (Pfeil) (F) und ER-Zisternen, die in der richtigen Struktur mit angehängten Ribosomen angeordnet sind (Pfeile). Maßstabsbalken:A,D:2 µm; B,C,E,F:200 nm. (G) Quantifizierung der Gesamtzahl der Mitochondrien/UMN in prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen mit 100 mg/kg/Tag NU-9-Behandlung; *p < .03. (H) Quantifizierung des Prozentsatzes gesunder Mitochondrien/UMN in prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen mit 100 mg/kg/Tag NU-9-Behandlung; ****p < .0001. (I) Quantifizierung der Anzahl der ER-Zisternen/UMN in prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen mit 100 mg/kg/Tag NU-9-Behandlung; ***p < .0003. (J) Quantifizierung der durchschnittlichen Länge von ER-Zisternen/UMN in prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen mit 100 mg/kg/Tag NU-9-Behandlung; ****p < .0001. Für statistische Analysen wurde eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest verwendet.
ABBILDUNG 7 Die Behandlung mit NU‐9 verbessert die zytoarchitektonische Integrität zerfallender apikaler Dendriten und eliminiert die fortschreitende Degeneration oberer Motoneuronen (UMNs), die aufgrund der TDP‐43-Pathologie erkranken. (A) Repräsentative Bilder von UMN-apikalen Dendriten im motorischen Kortex von unbehandelten prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen und (B) prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen, die mit 100 mg/kg/Tag NU-9 behandelt wurden. Der umrahmte Bereich ist rechts mit zusätzlichen repräsentativen Beispielen vergrößert. Maßstabsbalken:50 µm (geringe Vergrößerung), 10 µm (Einschub mit hoher Vergrößerung); n ≥ 3 biologische Replikate. (C) Repräsentatives Bild eines gesunden, intakten und (D) eines erkrankten, zerfallenden apikalen Dendriten. Maßstabsbalken:5 µm. (E) Durchschnittlicher Prozentsatz apikaler Dendriten mit Vakuolen pro Abschnittsfläche im motorischen Kortex; Mittelwert, Standardabweichung und einzelne Datenpunkte für n ≥ 3 biologische Replikate. **p < .01, ***p < .001, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. (F) Repräsentative Bilder von UMNs im motorischen Kortex von unbehandelten prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen und (G) prpTDP-43A315T, behandelt mit 100 mg/kg/Tag NU-9. Maßstabsbalken:50 µm; n ≥ 3 biologische Replikate. (H) Durchschnittliche Anzahl von UMNs pro Abschnittsfläche im motorischen Kortex; Mittelwert, Standardabweichung und einzelne Datenpunkte für n ≥ 3 biologische Replikate. *p < .05, **p < .01, ***p < .001, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest
ABBILDUNG 8 Die Behandlung mit NU‐9 verbessert nicht die Degeneration der unteren Motoneuronen (LMN), die aus der Toxizität von fehlgefaltetem SOD1 in vivo resultiert. (A und B) Repräsentative Bilder von LMNs im lumbalen Rückenmark von unbehandelten prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen oder behandelt mit 100 mg/kg/Tag NU-9. Maßstabsleiste:50 µm; n ≥ 3 biologische Replikate. (C–F) Repräsentative Bilder von LMNs im lumbalen Rückenmark von WT-UeGFP- oder hSOD1G93A-UeGFP-Mäusen, die mit Vehikel, 20 mg/kg/Tag NU-9 oder 100 mg/kg/Tag NU-9 behandelt wurden. Maßstabsleiste:50 µm; n = 5 biologische Replikate. (G) Durchschnittliche Anzahl von ChAT+ LMNs pro Abschnitt im lumbalen Rückenmark; Mittelwert, SEM und einzelne Datenpunkte für n = 5 biologische Replikate. ****p < .0001, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. (H) Durchschnittliche Anzahl von NeuN+/ChAT+ LMNs (anfällig für Degeneration) pro Abschnitt im lumbalen Rückenmark; Mittelwert, SEM und einzelne Datenpunkte für n = 5 biologische Replikate. ****p < .0001, einfache ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest. (I) Durchschnittliche Anzahl von GFP+/ChAT+ LMNs (resistent gegen Degeneration) pro Abschnitt im lumbalen Rückenmark; Mittelwert, SEM und einzelne Datenpunkte für n = 5 biologische Replikate
ABBILDUNG 9 Verhaltensdaten von WT-UeGFP-, hSOD1G93A-UeGFP- und prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäusen mit oder ohne NU-9-Behandlung. WT-UeGFP- und hSOD1G93A-UeGFP-Mäuse wurden alle 7 Tage zwischen dem postnatalen Tag (P)60 und P120 getestet; prpTDP-43A315T-UeGFP-Mäuse wurden bei P60, P90 und P120 getestet. (A) Gewicht der Mäuse in Gramm. Mittelwert und Standardabweichung für n ≥ 5 Mäuse pro Gruppe. WT-UeGFP (Vehikel) versus hSOD1G93A-UeGFP (Vehikel); #p < .05, zweifaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. (B) Latenzzeit, um auf den beschleunigenden Rotarod zu fallen, in Sekunden. Mittelwert und Standardabweichung für n ≥ 5 Mäuse pro Gruppe. WT-UeGFP (Vehikel) versus hSOD1G93A-UeGFP (Vehikel). #p < .05, ##p < .01, ###p < .001, ####p < .0001, Zweifaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. (C) Latenzzeit, um kopfüber von einem Drahtgitter zu fallen, in Sekunden. Mittelwert und Standardabweichung für n ≥ 5 Mäuse pro Gruppe. WT-UeGFP (Vehikel) versus hSOD1G93A-UeGFP (Vehikel). #p < .05, ###p < .001, ####p < .0001; hSOD1G93A-UeGFP (Vehikel) im Vergleich zu hSOD1G93A-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/Tag). *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, Zweifaktorielle ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. (D) Latenzzeit, um auf den beschleunigenden Rotarod zu fallen, in Sekunden. Mittelwert und Standardabweichung für n ≥ 4 Mäuse pro Gruppe. WT-UeGFP (Vehikel) versus prpTDP-43A315T-UeGFP (Vehikel). ##p < .01, ####p < .0001, Mixed-Effects-Analyse mit Tukeys Mehrfachvergleichstest. (E) Latenzzeit, um kopfüber von einem Drahtgitter zu fallen, in Sekunden. Mittelwert und Standardabweichung für n ≥ 3 Mäuse pro Gruppe. WT-UeGFP (Vehikel) versus prpTDP-43A315T-UeGFP (Vehikel), ####p < .0001; prpTDP-43A315T-UeGFP (unbehandelt) versus prpTDP-43A315T-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/Tag), ****p < .0001, Mixed-Effects-Analyse mit Tukeys Mehrfachvergleichstest