Barış Genç et al. Clin Transl Med. februar 2021
Baggrund: Øvre motorneuroner (UMN'er) er en nøglekomponent i motorneuronkredsløb. Deres degeneration er et kendetegn for sygdomme, såsom arvelig spastisk paraplegi (HSP), primær lateral sklerose (PLS) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS). I øjeblikket er der ingen prækliniske assays, der undersøger cellulære reaktioner fra UMN'er på sammensat behandling, selv for sygdomme i UMN'erne. Grundlaget for UMN-sårbarhed er ikke fuldt ud forstået, og der er endnu ikke identificeret nogen forbindelse til at forbedre sundheden for syge UMN'er:to store vejspærringer for opbygning af effektive behandlingsstrategier.
Metoder: Nye UMN-reportermodeller, hvor UMN'er, der er syge på grund af misfoldet superoxiddismutaseprotein (mSOD1) toksicitet og TDP-43-patologi, er mærket med eGFP-ekspression, tillader direkte vurdering af UMN-respons på forbindelsesbehandling. Elektronmikroskopi afslører meget præcise aspekter af endoplasmatisk retikulum (ER) og mitokondriel skade. Administration af NU-9, en forbindelse, der oprindeligt blev identificeret på baggrund af dens evne til at reducere mSOD1-toksicitet, har en dyb indvirkning på at forbedre sundheden og stabiliteten af UMN'er, som identificeret ved detaljerede cellulære og ultrastrukturelle analyser.
Resultater: Problemer med mitokondrier og ER er bevaret i syge UMN'er blandt forskellige arter. NU-9 har lægemiddellignende farmakokinetiske egenskaber. Det mangler toksicitet og krydser blod-hjernebarrieren. NU-9 forbedrer den strukturelle integritet af mitokondrier og ER, reducerer niveauer af mSOD1, stabiliserer degenererende UMN apikale dendritter, forbedrer motorisk adfærd målt ved den hængende wire-test og eliminerer igangværende degeneration af UMN'er, der bliver syge både på grund af mSOD1 toksicitet og TDP-43 vigtige årsager til neurologiske sygdomme og over 2-43 årsager. degeneration.
Konklusioner: Mekanisme-fokuserede og cellebaserede lægemiddelopdagelsestilgange adresserede ikke kun centrale cellulære defekter, der er ansvarlige for UMN-tab, men identificerede også NU-9, den første forbindelse til at forbedre sundheden for syge UMN'er, neuroner, der degenererer hos ALS-, HSP-, PLS- og ALS/FTLD-patienter.
Nøgleord: ALS; HSP; NU-9; PLS; TDP-43 patologi; mSOD1; øvre motoriske neuroner.
© 2021 Forfatterne. Klinisk og translationel medicin udgivet af John Wiley &Sons Australia, Ltd på vegne af Shanghai Institute of Clinical Bioinformatics.
PubMed ansvarsfraskrivelse
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.
FIGUR 1 Øvre motoriske neuroner (UMN'er) viser ultrastrukturelle defekter hos patienter med amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og i musemodeller, der er syge på grund af forskellige underliggende årsager. (A) Repræsentativt elektronmikroskopisk (EM) billede af UMN af normal kontrol forekommer intakt, mens (B) UMN af ALS-patient viser cytoarkitekturiske defekter. (C) EM billede af UMN af WT mus. (D) Repræsentativt EM-billede af UMN af hSOD1G93A og (E) prpTDP-43A315T-mus, der viser massiv ultrastrukturel desintegration. (F) Mitokondrierne i en normal kontrol, der viser intakte indre mitokondrielle membraner (pile), i modsætning til (G) mitokondrier hos ALS-patienter, der viser desintegration af indre mitokondriemembran (pilespidser). (H) Mitokondrier i WT-mus ser ud til at være strukturelt intakte med særskilte indre og ydre mitokondrielle membraner (pil), hvorimod (I) mitokondrier i UMN i en hSOD1G93A- og (J) prpTDP-43A315T-mus viser alvorlig mitokondrie-desintegration af indre membraner. (K) Elektronmikrofotografier af UMN endoplasmatisk retikulum (ER) i en normal kontrol viser korrekt stablede lange cisterner (pile), men (L) ER hos ALS-patient viser udspilning og ballondannelse af ER-cisterner (pilespidser). På samme måde ser (M) ER i en WT-mus (pile) strukturelt intakt ud i modsætning til (N) ER i UMN af hSOD1G93A og (O) prpTDP-43A315T mus, der viser knækkede, korte og disintegrerede ER-cisterner (pilespidser). (P) Kvantificering af gennemsnitlig procentdel af ER med cytoarkitekturiske defekter/UMN hos ALS-patienter. ****p < .0001, Elevens t-test. (Q) Kvantificering af gennemsnitlig procentdel af ER med cytoarkitektoniske defekter/UMN i hSOD1G93A. ****p < .0001 og prpTDP-43A315T-mus. ****p < .0001, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test. (R) Kvantificering af den gennemsnitlige længde af ER-cisterner/UMN hos ALS-patienter. **p < .001, Elevens t-test. (S) Kvantificering af gennemsnitlig længde af ER-cisterner/UMN i hSOD1G93A ****p < .0001 og prpTDP-43A315T-mus. ****p < .0001, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test. Skala søjler:A–E = 2 µm; F–O = 200 nm
FIGUR 2 NU-9-behandling forbedrer den ultrastrukturelle integritet af både mitokondrier og endoplasmatisk retikulum (ER) af øvre motorneuroner (UMN'er), der bliver syge af mutant SOD1-toksicitet. (A) Progression fra hit til at føre til NU-9 med kemisk struktur på NU-9. (B) Eksperimentelt design til in vivo undersøgelser. (C-F) Repræsentative elektronmikroskopiske (EM) billeder af UMN'er i den motoriske cortex af WT-UeGFP-mus behandlet med vehikel ved P120. Pile peger på mitokondrier med intakt indre membran og ER med intakte cisterner. Skala søjler, C:2 µm; D–F:200 nm. (G-J) Repræsentative EM-billeder af UMN'er i den motoriske cortex af hSOD1G93A-UeGFP-mus behandlet med vehikel ved P120. (G) Cytoplasmaet er for det meste blottet for vigtige nøgleorganeller, og (H) der er talrige elektrontætte aggregater (pilespidser) og store dråber. (I) Mitokondrier, der mistede integriteten af sin indre membran (pilespids) eller har overordnet strukturel skade, og (J) fragmenterede stykker af ER (pilespidser) er tydelige. Skala søjler, G:2 µm; H–J:200 nm. (K-N) Repræsentative EM-billeder af UMN'er i den motoriske cortex af hSOD1G93A-UeGFP-mus behandlet med 100 mg/kg/dag NU-9. (K) Samlet forbedring i cytoplasmaet med tilstedeværelsen af adskillige organeller. (L) Mitokondrier ser ud til at være sunde (pile), og cytoplasmaet mangler større tætte aggregater og dråber. (M) Integriteten af den indre mitokondrielle membran og cristae-strukturen genoprettes (pile), og (N) ER-cisterner (pile) er arrangeret i korrekt struktur uden nogen fragmentering. Skala søjler, I:2 µm; L–N:200 nm. (O) Kvantificering af det samlede antal mitokondrier/UMN i hSOD1G93A-UeGFP-mus med NU-9-behandling. **p < .006, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test. (P) Kvantificering af procentdelen af sunde mitokondrier/UMN i hSOD1G93A-UeGFP-mus med NU-9-behandling. ****p < .0001, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test. (Q) Kvantificering af antallet af ER-cisterner/UMN i hSOD1G93A-UeGFP-mus med NU-9-behandling. *p < .016, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test. (R) Kvantificering af gennemsnitlig længde af ER-cisterner/UMN i hSOD1G93A-UeGFP-mus med NU-9-behandling. **p < .002, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test
FIGUR 3 NU-9-behandling reducerer fejlfoldede SOD1-niveauer i øvre motorneuroner (UMN'er) af hSOD1G93A-UeGFP-mus. (A) Repræsentative billeder af UMN'er og B8H10-antistoffarvning, der genkender forkert foldet SOD1-protein i den motoriske cortex af WT-UeGFP eller (B) hSOD1G93A-UeGFP-mus behandlet med vehikel, (C) 20 mg/kg/dag NU-9 eller (D)- 900 mg/dag. Skala søjler, 20 µm; n ≥ 3 biologiske replikater. (E) Gennemsnitlig integreret tæthed af fejlfoldet SOD1-fluorescens i UMN'er i den motoriske cortex af WT-UeGFP- eller hSOD1G93A-UeGFP-mus behandlet med vehikel, 20 mg/kg/dag NU-9 eller 100 mg/kg/dag NU-9; gennemsnit, SEM og individuelle datapunkter vist for n ≥ 3 biologiske replikater. **p < .01, ****p < .0001, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test
FIGUR 4 NU-9-behandling forbedrer den cytoarkitektoniske integritet af disintegrerende apikale dendritter af øvre motorneuroner (UMN'er), der bliver syge af fejlfoldet SOD1-toksicitet. (A) Repræsentative billeder af UMN apikale dendritter i den motoriske cortex af WT-UeGFP eller (B) hSOD1G93A-UeGFP-mus behandlet med vehikel, (C) 20 mg/kg/dag NU-9 eller (D) 100 mg/kg/dag NU-9. Indrammede områder er forstørret til højre, og yderligere eksempler medfølger. Skala søjler:50 µm (lav mag), 10 µm (høj mag indsat); n ≥ 6 biologiske replikater. (E) Repræsentativt billede af en sund, intakt og (F) en syg, disintegrerende apikal dendrit. Skala søjler:5 µm. (G) Gennemsnitlig procentdel af UMN apikale dendritter med vakuoler pr. sektion i den motoriske cortex; gennemsnit, SEM og individuelle datapunkter vist for n ≥ 6 biologiske replikater. *p < .05, **p < .01, envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test
FIGUR 5 NU-9-behandling reducerer degeneration af øvre motorneuron (UMN) af syge UMN'er som følge af forkert foldet SOD1-toksicitet in vivo. (A-D) Repræsentative billeder af UMN'er i den motoriske cortex af WT-UeGFP- eller hSOD1G93A-UeGFP-mus behandlet med vehikel, 20 mg/kg/dag NU-9 eller 100 mg/kg/dag NU-9. Skala søjler:50 µm; n ≥ 5 biologiske replikater. (E) Gennemsnitligt antal UMN'er pr. sektion i den motoriske cortex; gennemsnit, SEM og individuelle datapunkter vist for n ≥ 5 biologiske replikater. *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test
FIGUR 6 NU-9-behandling forbedrer den ultrastrukturelle integritet af både mitokondrier og endoplasmatisk retikulum (ER) af øvre motorneuroner (UMN'er), der bliver syge på grund af TDP-43-patologi. Mitokondrie- og ER-defekter i UMN'erne af prpTDP-43A315T-UeGFP-mus blev tidligere offentliggjort. (A-C) Repræsentative elektronmikroskopiske billeder af UMN'er af ubehandlede prpTDP-43A315T-UeGFP-mus. (A) UMN soma, med få intakte organeller. (B) Mitokondrier mister integriteten af deres indre membran (pilespidser), og (C) ER cisterner er disintegrerede og knækkede (pilespidser). (D-F) Repræsentative elektronmikroskopiske billeder af UMN'er af prpTDP-43A315T-UeGFP-mus behandlet med 100 mg/kg/dag NU-9. (D) En generel forbedring i cytoarkitekturen er påvist med korrekt nuklear membran, tilstedeværelse af talrige sunde organeller og mangel på elektrontætte aggregater. (E) Mitokondrier virker sunde med forbedret indre membran og cristae (pil) (F), og ER-cisterner arrangeret i korrekt struktur med ribosomer vedhæftet (pile). Skala søjler:A,D:2 µm; B,C,E,F:200 nm. (G) Kvantificering af det samlede antal mitokondrier/UMN i prpTDP-43A315T-UeGFP-mus med 100 mg/kg/dag NU-9-behandling; *p < .03. (H) Kvantificering af procentdelen af sunde mitokondrier/UMN i prpTDP-43A315T-UeGFP-mus med 100 mg/kg/dag NU-9-behandling; ****p < .0001. (I) Kvantificering af antallet af ER-cisterner/UMN i prpTDP-43A315T-UeGFP-mus med 100 mg/kg/dag NU-9-behandling; ***p < .0003. (J) Kvantificering af gennemsnitlig længde af ER-cisterner/UMN i prpTDP-43A315T-UeGFP-mus med 100 mg/kg/dag NU-9-behandling; ****p < .0001. Envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-sammenligningstest blev brugt til statistiske analyser
FIGUR 7 NU-9-behandling forbedrer den cytoarkitektoniske integritet af disintegrerende apikale dendritter og eliminerer progressiv degeneration af øvre motorneuroner (UMN'er), der bliver syge på grund af TDP-43-patologi. (A) Repræsentative billeder af UMN apikale dendritter i den motoriske cortex af ubehandlede prpTDP-43A315T-UeGFP-mus og (B) prpTDP-43A315T-UeGFP-mus behandlet med 100 mg/kg/dag af NU-9. Indrammet område er forstørret til højre med yderligere repræsentative eksempler. Skala søjler:50 µm (lav mag), 10 µm (høj mag indsat); n ≥ 3 biologiske replikater. (C) Repræsentativt billede af en sund, intakt og (D) en syg, disintegrerende apikal dendrit. Skala søjler:5 µm. (E) Gennemsnitlig procentdel af apikale dendritter med vakuoler pr. sektionsareal i den motoriske cortex; gennemsnit, SEM og individuelle datapunkter vist for n ≥ 3 biologiske replikater. **p < .01, ***p < .001, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test. (F) Repræsentative billeder af UMN'er i den motoriske cortex af ubehandlede prpTDP-43A315T-UeGFP-mus og (G) prpTDP-43A315T behandlet med 100 mg/kg/dag NU-9. Skala søjler:50 µm; n ≥ 3 biologiske replikater. (H) Gennemsnitligt antal UMN'er pr. sektionsområde i den motoriske cortex; gennemsnit, SEM og individuelle datapunkter vist for n ≥ 3 biologiske replikater. *p < .05, **p < .01, ***p < .001, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test
FIGUR 8 NU-9-behandling forbedrer ikke degeneration af lavere motorneuroner (LMN) som følge af forkert foldet SOD1-toksicitet in vivo. (A og B) Repræsentative billeder af LMN'er i lænderygmarven på ubehandlede prpTDP-43A315T-UeGFP-mus eller behandlet med 100 mg/kg/dag NU-9. Målestok:50 µm; n ≥ 3 biologiske replikater. (C–F) Repræsentative billeder af LMN'er i lænderygmarven på WT-UeGFP- eller hSOD1G93A-UeGFP-mus behandlet med vehikel, 20 mg/kg/dag NU-9 eller 100 mg/kg/dag NU-9. Målestok:50 µm; n = 5 biologiske replikater. (G) Gennemsnitligt antal ChAT+ LMN'er pr. sektion i den lumbale rygmarv; gennemsnit, SEM og individuelle datapunkter vist for n = 5 biologiske replikater. ****p < .0001, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test. (H) Gennemsnitligt antal NeuN+/ChAT+ LMN'er (sårbare over for degeneration) pr. sektion i lænderygmarven; gennemsnit, SEM og individuelle datapunkter vist for n = 5 biologiske replikater. ****p < .0001, One-way ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-comparison test. (I) Gennemsnitligt antal GFP+/ChAT+ LMN'er (resistente over for degeneration) pr. sektion i lumbal rygmarv; gennemsnit, SEM og individuelle datapunkter vist for n = 5 biologiske replikater
FIGUR 9 Adfærdsdata for WT-UeGFP-, hSOD1G93A-UeGFP- og prpTDP-43A315T-UeGFP-mus med eller uden NU-9-behandling. WT-UeGFP- og hSOD1G93A-UeGFP-mus blev testet hver 7. dag mellem postnatal dag (P)60 og P120; prpTDP-43A315T-UeGFP-mus blev testet ved P60, P90 og P120. (A) Musenes vægt i gram. Gennemsnit og SEM vist for n ≥ 5 mus pr. gruppe. WT‐UeGFP (køretøj) versus hSOD1G93A‐UeGFP (køretøj); #p < .05, to-vejs ANOVA med Tukeys multiple-sammenligningstest. (B) Latency til at falde på accelererende rotarod i sekunder. Gennemsnit og SEM vist for n ≥ 5 mus pr. gruppe. WT‐UeGFP (køretøj) versus hSOD1G93A‐UeGFP (køretøj). #p < .05, ##p < .01, ###p < .001, ####p < .0001, To-vejs ANOVA med Tukeys multiple-sammenligningstest. (C) Ventetid til at falde hængende på hovedet fra et trådnet på få sekunder. Gennemsnit og SEM vist for n ≥ 5 mus pr. gruppe. WT‐UeGFP (køretøj) versus hSOD1G93A‐UeGFP (køretøj). #p < .05, ###p < .001, ####p < .0001; hSOD1G93A-UeGFP (køretøj) versus hSOD1G93A-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/dag). *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, To-vejs ANOVA med Tukeys multiple-sammenligningstest. (D) Latens til at falde ved accelererende rotarod i sekunder. Gennemsnit og SEM vist for n ≥ 4 mus pr. gruppe. WT‐UeGFP (køretøj) versus prpTDP‐43A315T‐UeGFP (køretøj). ##p < .01, ####p < .0001, Mixed-effects-analyse med Tukeys multipel-sammenligningstest. (E) Ventetid til at falde hængende på hovedet fra et trådnet på sekunder. Gennemsnit og SEM vist for n ≥ 3 mus pr. gruppe. WT‐UeGFP (køretøj) versus prpTDP‐43A315T‐UeGFP (køretøj), ####p < .0001; prpTDP-43A315T-UeGFP (ubehandlet) versus prpTDP-43A315T-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/dag), ****p < .0001, blandet-effektanalyse med Tukeys multiple-sammenligningstest