Barış Genç et al. Clin Transl Med. 2021 februari.
Achtergrond: Bovenste motorneuronen (UMN's) zijn een sleutelcomponent van de circuits van motorneuronen. Hun degeneratie is een kenmerk van ziekten, zoals erfelijke spastische paraplegie (HSP), primaire laterale sclerose (PLS) en amyotrofische laterale sclerose (ALS). Momenteel zijn er geen preklinische tests die de cellulaire reacties van UMN's op samengestelde behandeling onderzoeken, zelfs niet voor ziekten van de UMN's. De basis van de kwetsbaarheid van UMN wordt nog niet volledig begrepen, en er is nog geen middel geïdentificeerd dat de gezondheid van zieke UMN’s kan verbeteren:twee belangrijke obstakels voor het ontwikkelen van effectieve behandelstrategieën.
Methoden: Nieuwe UMN-reportermodellen, waarin UMN's die ziek zijn vanwege de toxiciteit van verkeerd gevouwen superoxide-dismutase-eiwit (mSOD1) en TDP-43-pathologie, worden gelabeld met eGFP-expressie, maken een directe beoordeling van de UMN-respons op samengestelde behandeling mogelijk. Elektronenmicroscopie onthult zeer precieze aspecten van endoplasmatisch reticulum (ER) en mitochondriale schade. Toediening van NU-9, een verbinding die aanvankelijk werd geïdentificeerd op basis van zijn vermogen om de mSOD1-toxiciteit te verminderen, heeft een diepgaande invloed op het verbeteren van de gezondheid en stabiliteit van UMN's, zoals geïdentificeerd door gedetailleerde cellulaire en ultrastructurele analyses.
Resultaten: Problemen met mitochondriën en ER blijven behouden bij zieke UMN's bij verschillende soorten. NU-9 heeft medicijnachtige farmacokinetische eigenschappen. Het mist toxiciteit en passeert de bloed-hersenbarrière. NU-9 verbetert de structurele integriteit van de mitochondriën en ER, vermindert de niveaus van mSOD1, stabiliseert degenererende UMN apicale dendrieten, verbetert het motorische gedrag gemeten door de hangende draadtest, en elimineert de voortdurende degeneratie van UMN's die ziek worden, zowel vanwege mSOD1-toxiciteit als door TDP-43-pathologie, twee verschillende en belangrijke overkoepelende oorzaken van degeneratie van motorneuronen.
Conclusies: Mechanismegerichte en celgebaseerde benaderingen voor de ontdekking van geneesmiddelen richtten zich niet alleen op de belangrijkste cellulaire defecten die verantwoordelijk zijn voor UMN-verlies, maar identificeerden ook NU-9, de eerste verbinding die de gezondheid van zieke UMN's verbetert, neuronen die degenereren bij ALS-, HSP-, PLS- en ALS/FTLD-patiënten.
Trefwoorden: ALS; HSP; NU-9; PLS; TDP-43-pathologie; mSOD1; bovenste motorneuronen.
© 2021 De auteurs. Clinical and Translational Medicine gepubliceerd door John Wiley &Sons Australia, Ltd namens het Shanghai Institute of Clinical Bioinformatics.
PubMed-disclaimer
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
FIGUUR 1 Hogere motorneuronen (UMN's) vertonen ultrastructurele defecten bij patiënten met amyotrofische laterale sclerose (ALS), en in de muismodellen die ziek zijn vanwege verschillende onderliggende oorzaken. (A) Representatief elektronenmicroscopisch (EM) beeld van UMN met normale controle lijkt intact, terwijl (B) UMN van ALS-patiënt cytoarchitecturale defecten vertoont. (C) EM-afbeelding van UMN van WT-muis. (D) Representatief EM-beeld van UMN van hSOD1G93A, en (E) prpTDP-43A315T-muis die enorme ultrastructurele desintegratie vertoont. (F) De mitochondriën in een normale controle tonen intacte binnenste mitochondriale membranen (pijlen), in tegenstelling tot (G) mitochondriën bij ALS-patiënten die de desintegratie van het binnenste mitochondriale membraan vertonen (pijlpunten). (H) Mitochondria in WT-muis lijken structureel intact te zijn met verschillende binnen- en buitenmitochondriale membranen (pijl), terwijl (I) mitochondriën in UMN in een hSOD1G93A- en (J) prpTDP-43A315T-muis ernstige desintegratie van binnenste mitochondriale membranen vertonen (pijlpunten). (K) Elektronenmicrofoto's van UMN-endoplasmatisch reticulum (ER) in een normale controle geven correct gestapelde lange cisternae (pijlen) weer, maar (L) ER bij ALS-patiënten vertoont uitzetting en ballonvorming van ER-cisternae (pijlpunten). Op dezelfde manier ziet (M) ER in een WT-muis (pijlen) er structureel intact uit in tegenstelling tot (N) ER in UMN van hSOD1G93A en (O) prpTDP-43A315T-muis die gebroken, korte en gedesintegreerde ER-cisternae vertoont (pijlpunten). (P) Kwantificering van het gemiddelde percentage ER met cytoarchitecturale defecten/UMN bij ALS-patiënten. ****p < .0001, Student-t-test. (Q) Kwantificering van het gemiddelde percentage ER met cytoarchitecturale defecten/UMN in hSOD1G93A. ****p < .0001 en prpTDP-43A315T-muizen. ****p < .0001, One-way ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest. (R) Kwantificering van de gemiddelde lengte van ER cisternae/UMN bij ALS-patiënten. **p < .001, Student-t-test. (S) Kwantificering van de gemiddelde lengte van ER cisternae/UMN in hSOD1G93A **** p <.0001 en prpTDP-43A315T muizen. ****p < .0001, One-way ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest. Schaalbalken:A – E =2 µm; F–O = 200 nm
FIGUUR 2 NU-9-behandeling verbetert de ultrastructurele integriteit van zowel de mitochondriën als het endoplasmatisch reticulum (ER) van de bovenste motorneuronen (UMN's) die ziek worden door mutante SOD1-toxiciteit. (A) Voortgang van hit tot lead naar NU-9 met chemische structuur van NU-9. (B) Experimenteel ontwerp voor in vivo onderzoeken. (C – F) Representatieve elektronenmicroscopische (EM) beelden van UMN's in de motorcortex van WT-UeGFP-muizen behandeld met voertuig op P120. Pijlen wijzen naar mitochondriën met intact binnenmembraan en ER met intacte cisternae. Schaalbalken, C:2 µm; D – F:200 nm. (G-J) Representatieve EM-beelden van UMN's in de motorcortex van hSOD1G93A-UeGFP-muizen behandeld met vehikel op P120. (G) Het cytoplasma is grotendeels verstoken van belangrijke belangrijke organellen, en (H) er zijn talloze elektronendichte aggregaten (pijlpunten) en grote druppels. (I) Mitochondria die de integriteit van het binnenmembraan (pijlpunt) hebben verloren of algehele structurele schade hebben, en (J) gefragmenteerde stukken van het ER (pijlpunten) zijn duidelijk zichtbaar. Schaalbalken, G:2 µm; H-J:200 nm. (K-N) Representatieve EM-beelden van UMN's in de motorcortex van hSOD1G93A-UeGFP-muizen behandeld met 100 mg/kg/dag NU-9. (K) Algemene verbetering in het cytoplasma met de aanwezigheid van talrijke organellen. (L) Mitochondria lijken gezond te zijn (pijlen) en het cytoplasma mist grote dichte aggregaten en druppels. (M) De integriteit van het binnenste mitochondriale membraan en de cristae-structuur is hersteld (pijlen), en (N) ER cisternae (pijlen) zijn in de juiste structuur gerangschikt zonder enige fragmentatie. Schaalbalken, I:2 µm; L-N:200 nm. (O) Kwantificering van het totale aantal mitochondria/UMN in hSOD1G93A-UeGFP-muizen met NU-9-behandeling. **p < .006, eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest. (P) Kwantificering van het percentage gezonde mitochondria/UMN in hSOD1G93A-UeGFP-muizen met NU-9-behandeling. ****p < .0001, One-way ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest. (Q) Kwantificering van het aantal ER cisternae/UMN in hSOD1G93A-UeGFP muizen met NU-9-behandeling. *p <.016, eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest. (R) Kwantificering van de gemiddelde lengte van ER cisternae/UMN in hSOD1G93A-UeGFP muizen met NU-9-behandeling. **p < .002, eenrichtings-ANOVA gevolgd door de post-hoc meervoudige vergelijkingstest van Tukey
FIGUUR 3 Behandeling met NU-9 vermindert verkeerd gevouwen SOD1-niveaus in de bovenste motorneuronen (UMN's) van hSOD1G93A-UeGFP-muizen. (A) Representatieve afbeeldingen van UMN's en B8H10-antilichaamkleuring die verkeerd gevouwen SOD1-eiwit herkent in de motorcortex van WT-UeGFP of (B) hSOD1G93A-UeGFP-muizen behandeld met vehiculum, (C) 20 mg/kg/dag NU-9, of (D) 100 mg/kg/dag NU-9. Schaalstaven, 20 µm; n ≥ 3 biologische replicaten. (E) Gemiddelde geïntegreerde dichtheid van verkeerd gevouwen SOD1-fluorescentie in UMN's in de motorcortex van WT-UeGFP- of hSOD1G93A-UeGFP-muizen behandeld met vehiculum, 20 mg/kg/dag NU-9, of 100 mg/kg/dag NU-9; gemiddelde, SEM en individuele gegevenspunten weergegeven voor n ≥ 3 biologische replicaties. **p < .01, ****p < .0001, One-way ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest
FIGUUR 4 NU-9-behandeling verbetert de cytoarchitecturale integriteit van desintegrerende apicale dendrieten van bovenste motorneuronen (UMN's) die ziek worden door verkeerd gevouwen SOD1-toxiciteit. (A) Representatieve afbeeldingen van UMN apicale dendrieten in de motorcortex van WT-UeGFP of (B) hSOD1G93A-UeGFP muizen behandeld met vehiculum, (C) 20 mg/kg/dag NU-9, of (D) 100 mg/kg/dag NU-9. De omkaderde gebieden worden naar rechts vergroot en er worden aanvullende voorbeelden gegeven. Schaalbalken:50 µm (lage mag), 10 µm (hoge mag-inzet); n ≥ 6 biologische replicaties. (E) Representatief beeld van een gezonde, intacte en (F) een zieke, desintegrerende apicale dendriet. Schaalbalken:5 µm. (G) Gemiddeld percentage UMN apicale dendrieten met vacuolen per sectie in de motorcortex; gemiddelde, SEM en individuele gegevenspunten weergegeven voor n ≥ 6 biologische replicaties. *p < .05, **p < .01, eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest
FIGUUR 5 NU-9-behandeling vermindert de degeneratie van de bovenste motorneuronen (UMN) van zieke UMN's als gevolg van verkeerd gevouwen SOD1-toxiciteit in vivo. (A-D) Representatieve afbeeldingen van UMN's in de motorcortex van WT-UeGFP- of hSOD1G93A-UeGFP-muizen behandeld met vehiculum, 20 mg/kg/dag NU-9, of 100 mg/kg/dag NU-9. Schaalbalken:50 µm; n ≥ 5 biologische replicaten. (E) Gemiddeld aantal UMN's per sectie in de motorcortex; gemiddelde, SEM en individuele gegevenspunten weergegeven voor n ≥ 5 biologische replicaties. *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, One-way ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest
FIGUUR 6 NU-9-behandeling verbetert de ultrastructurele integriteit van zowel de mitochondriën als het endoplasmatisch reticulum (ER) van de bovenste motorneuronen (UMN's) die ziek worden als gevolg van TDP-43-pathologie. Mitochondriale en ER-defecten in de UMN's van prpTDP-43A315T-UeGFP-muizen zijn eerder gepubliceerd. (A – C) Representatieve elektronenmicroscopische beelden van UMN's van onbehandelde prpTDP-43A315T-UeGFP-muizen. (A) UMN soma, met weinig intacte organellen. (B) Mitochondria verliezen de integriteit van hun binnenmembraan (pijlpunten), en (C) ER cisternae zijn gedesintegreerd en gebroken (pijlpunten). (D-F) Representatieve elektronenmicroscopische beelden van UMN's van prpTDP-43A315T-UeGFP-muizen behandeld met 100 mg/kg/dag NU-9. (D) Een algehele verbetering in de cytoarchitectuur blijkt uit het juiste kernmembraan, de aanwezigheid van talrijke gezonde organellen en het ontbreken van elektronendichte aggregaten. (E) Mitochondria lijken gezond met verbeterd binnenmembraan en cristae (pijl) (F), en ER cisternae gerangschikt in de juiste structuur met daaraan bevestigde ribosomen (pijlen). Schaalbalken:A,D:2 µm; B,C,E,F:200 nm. (G) Kwantificering van het totale aantal mitochondria/UMN in prpTDP-43A315T-UeGFP muizen met 100 mg/kg/dag NU-9-behandeling; *p < .03. (H) Kwantificering van het percentage gezonde mitochondriën/UMN in prpTDP-43A315T-UeGFP muizen met 100 mg/kg/dag NU-9-behandeling; ****p < .0001. (I) Kwantificering van het aantal ER cisternae/UMN in prpTDP-43A315T-UeGFP muizen met 100 mg/kg/dag NU-9-behandeling; ***p < .0003. (J) Kwantificering van de gemiddelde lengte van ER cisternae/UMN in prpTDP-43A315T-UeGFP muizen met 100 mg/kg/dag NU-9-behandeling; ****p < .0001. Voor statistische analyses werd een eenrichtings-ANOVA gebruikt, gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest.
FIGUUR 7 NU-9-behandeling verbetert de cytoarchitecturale integriteit van desintegrerende apicale dendrieten en elimineert de progressieve degeneratie van bovenste motorneuronen (UMN's) die ziek worden als gevolg van TDP-43-pathologie. (A) Representatieve afbeeldingen van UMN-apische dendrieten in de motorcortex van onbehandelde prpTDP-43A315T-UeGFP-muizen en (B) prpTDP-43A315T-UeGFP-muizen behandeld met 100 mg/kg/dag NU-9. Het omkaderde gebied is naar rechts vergroot met aanvullende representatieve voorbeelden. Schaalbalken:50 µm (lage mag), 10 µm (hoge mag-inzet); n ≥ 3 biologische replicaten. (C) Representatief beeld van een gezonde, intacte en (D) een zieke, desintegrerende apicale dendriet. Schaalbalken:5 µm. (E) Gemiddeld percentage apicale dendrieten met vacuolen per sectiegebied in de motorcortex; gemiddelde, SEM en individuele gegevenspunten weergegeven voor n ≥ 3 biologische replicaties. **p < .01, ***p < .001, One-way ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest. (F) Representatieve afbeeldingen van UMN's in de motorcortex van onbehandelde prpTDP-43A315T-UeGFP-muizen en (G) prpTDP-43A315T behandeld met 100 mg/kg/dag NU-9. Schaalbalken:50 µm; n ≥ 3 biologische replicaten. (H) Gemiddeld aantal UMN's per sectiegebied in de motorcortex; gemiddelde, SEM en individuele gegevenspunten weergegeven voor n ≥ 3 biologische replicaties. *p < .05, **p < .01, ***p < .001, One-way ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest
FIGUUR 8 Behandeling met NU-9 verbetert de degeneratie van de lagere motorneuronen (LMN) als gevolg van verkeerd gevouwen SOD1-toxiciteit in vivo niet. (A en B) Representatieve afbeeldingen van LMN's in het lumbale ruggenmerg van onbehandelde prpTDP-43A315T-UeGFP-muizen of behandeld met 100 mg/kg/dag NU-9. Schaalbalk:50 µm; n ≥ 3 biologische replicaten. (C-F) Representatieve afbeeldingen van LMN's in het lumbale ruggenmerg van WT-UeGFP- of hSOD1G93A-UeGFP-muizen behandeld met vehiculum, 20 mg/kg/dag NU-9, of 100 mg/kg/dag NU-9. Schaalbalk:50 µm; n = 5 biologische replicaten. (G) Gemiddeld aantal ChAT+ LMN's per sectie in het lumbale ruggenmerg; gemiddelde, SEM en individuele gegevenspunten weergegeven voor n =5 biologische replicaties. ****p < .0001, One-way ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest. (H) Gemiddeld aantal NeuN+/ChAT+ LMN’s (kwetsbaar voor degeneratie) per sectie in het lumbale ruggenmerg; gemiddelde, SEM en individuele gegevenspunten weergegeven voor n =5 biologische replicaties. ****p < .0001, One-way ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc meervoudige vergelijkingstest. (I) Gemiddeld aantal GFP+/ChAT+ LMN's (resistent tegen degeneratie) per sectie in het lumbale ruggenmerg; gemiddelde, SEM en individuele gegevenspunten weergegeven voor n = 5 biologische replicaties
FIGUUR 9 Gedragsgegevens van WT-UeGFP-, hSOD1G93A-UeGFP- en prpTDP-43A315T-UeGFP-muizen met of zonder NU-9-behandeling. WT-UeGFP- en hSOD1G93A-UeGFP-muizen werden elke 7 dagen getest tussen postnatale dag (P) 60 en P120; prpTDP-43A315T-UeGFP-muizen werden getest op P60, P90 en P120. (A) Gewicht van de muizen in grammen. Gemiddelde en SEM weergegeven voor n ≥ 5 muizen per groep. WT-UeGFP (voertuig) versus hSOD1G93A-UeGFP (voertuig); #p < .05, tweerichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. (B) De latentie daalt binnen enkele seconden bij het versnellen van de rotarod. Gemiddelde en SEM weergegeven voor n ≥ 5 muizen per groep. WT-UeGFP (voertuig) versus hSOD1G93A-UeGFP (voertuig). #p < .05, ##p < .01, ###p < .001, ####p < .0001, tweeweg-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. (C) Latentie om binnen enkele seconden ondersteboven aan een draadrooster te vallen. Gemiddelde en SEM weergegeven voor n ≥ 5 muizen per groep. WT-UeGFP (voertuig) versus hSOD1G93A-UeGFP (voertuig). #p < .05, ###p < .001, ####p < .0001; hSOD1G93A-UeGFP (voertuig) versus hSOD1G93A-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/dag). *p < .05, ***p < .001, ****p < .0001, tweeweg-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. (D) Latentie die binnen enkele seconden daalt bij het versnellen van de rotarod. Gemiddelde en SEM weergegeven voor n ≥ 4 muizen per groep. WT-UeGFP (voertuig) versus prpTDP-43A315T-UeGFP (voertuig). ##p < .01, ####p < .0001, analyse van gemengde effecten met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. (E) Latentie om binnen enkele seconden ondersteboven aan een draadrooster te vallen. Gemiddelde en SEM weergegeven voor n ≥ 3 muizen per groep. WT-UeGFP (voertuig) versus prpTDP-43A315T-UeGFP (voertuig), ####p < .0001; prpTDP-43A315T-UeGFP (onbehandeld) versus prpTDP-43A315T-UeGFP (NU-9 100 mg/kg/dag), ****p <.0001, analyse van gemengde effecten met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey