Barış Genç 외. Clin Transl Med. 2021년 2월
배경: 상위 운동 뉴런(UMN)은 운동 뉴런 회로의 핵심 구성 요소입니다. 이들의 퇴행은 유전성 경직성 하반신 마비(HSP), 원발성 측삭 경화증(PLS), 근위축성 측삭 경화증(ALS)과 같은 질병의 특징입니다. 현재 UMN의 질병에 대해서도 복합 치료에 대한 UMN의 세포 반응을 조사하는 전임상 분석은 없습니다. UMN 취약성의 기초는 완전히 이해되지 않았으며 질병에 걸린 UMN의 건강을 개선하기 위한 화합물은 아직 확인되지 않았습니다. 이는 효과적인 치료 전략을 구축하는 데 두 가지 주요 장애물입니다.
방법: 잘못 접힌 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 단백질(mSOD1) 독성 및 TDP-43 병리로 인해 질병에 걸린 UMN이 eGFP 발현으로 표지된 새로운 UMN 리포터 모델을 사용하면 화합물 치료에 대한 UMN 반응을 직접 평가할 수 있습니다. 전자현미경은 소포체(ER)와 미토콘드리아 손상의 매우 정확한 측면을 보여줍니다. mSOD1 독성을 감소시키는 능력을 기반으로 초기에 확인된 화합물인 NU-9의 투여는 상세한 세포 및 미세구조 분석을 통해 확인된 바와 같이 UMN의 건강 및 안정성을 개선하는 데 지대한 영향을 미칩니다.
결과: 미토콘드리아와 ER의 문제는 다양한 종의 질병에 걸린 UMN에서 보존됩니다. NU-9는 약물과 유사한 약동학적 특성을 가지고 있습니다. 독성이 부족하고 혈액뇌장벽을 통과합니다. NU-9는 미토콘드리아와 ER의 구조적 완전성을 개선하고, mSOD1 수준을 감소시키고, 퇴화하는 UMN 정점 수상돌기를 안정화하고, 매달린 와이어 테스트로 측정된 운동 행동을 개선하고, 운동 뉴런 퇴화의 두 가지 뚜렷하고 중요한 주요 원인인 mSOD1 독성과 TDP-43 병리로 인해 질병에 걸리게 되는 진행 중인 UMN의 퇴행을 제거합니다.
결론: 메커니즘 중심의 세포 기반 약물 발견 접근법은 UMN 손실을 담당하는 주요 세포 결함을 해결할 뿐만 아니라 ALS, HSP, PLS 및 ALS/FTLD 환자에서 퇴행하는 뉴런인 질병이 있는 UMN의 건강을 개선하는 최초의 화합물인 NU-9를 식별했습니다.
키워드: 루게릭병; HSP; NU-9; PLS; TDP-43 병리학; mSOD1; 상부 운동 뉴런.
© 2021 저자. Shanghai Institute of Clinical Bioinformatics를 대신하여 John Wiley &Sons Australia, Ltd가 출판한 임상 및 중개 의학.
PubMed 면책조항
저자는 이해상충이 없음을 선언합니다.
그림 1 상부 운동 뉴런(UMN)은 근위축성 측삭 경화증(ALS) 환자와 다양한 근본 원인으로 인해 질병에 걸린 마우스 모델에서 미세구조적 결함을 나타냅니다. (A) 정상 대조군의 UMN의 대표적인 전자 현미경(EM) 이미지는 그대로 나타나는 반면, (B) ALS 환자의 UMN은 세포구조적 결함을 나타냅니다. (C) WT 마우스의 UMN의 EM 이미지. (D) hSOD1G93A의 UMN의 대표적인 EM 이미지 및 (E) 대규모 미세구조 붕괴를 나타내는 prpTDP‐43A315T 마우스. (F) 내부 미토콘드리아 막(화살촉)의 붕괴를 표시하는 ALS 환자의 (G) 미토콘드리아와 달리 손상되지 않은 내부 미토콘드리아 막(화살표)을 보여주는 정상 대조군의 미토콘드리아. (H) WT 마우스의 미토콘드리아는 뚜렷한 내부 및 외부 미토콘드리아 막(화살표)으로 구조적으로 온전한 것으로 보이는 반면, (I) hSOD1G93A의 UMN의 미토콘드리아 및 (J) prpTDP‐43A315T 마우스는 내부 미토콘드리아 막의 심각한 붕괴를 나타냅니다(화살촉). (K) 정상 대조군의 UMN 소포체(ER)의 전자 현미경 사진은 적절하게 쌓인 긴 수조(화살표)를 표시하지만, (L) ALS 환자의 ER은 ER 수조의 팽창 및 풍선화(화살촉)를 보여줍니다. 마찬가지로, (M) WT 마우스의 ER(화살표)은 (N) hSOD1G93A의 UMN에 있는 ER 및 (O) prpTDP‐43A315T 마우스가 부러지고 짧고 분해된 ER 수조(화살촉)를 표시하는 것과 대조적으로 구조적으로 손상되지 않은 것처럼 보입니다. (P) ALS 환자에서 세포구조적 결함/UMN이 있는 ER의 평균 백분율 정량화. ****p < .0001, 스튜던트 t-테스트. (Q) hSOD1G93A에서 세포구조적 결함/UMN이 있는 ER의 평균 백분율 정량화. ****p < .0001 및 prpTDP‐43A315T 마우스. ****p < .0001, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트가 수행됩니다. (R) ALS 환자의 ER 수조/UMN의 평균 길이 정량화. **p < .001, 스튜던트 t-테스트. (S) hSOD1G93A **** p <.0001 및 prpTDP‐43A315T 마우스에서 ER 수조/UMN의 평균 길이 정량화. ****p < .0001, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트가 수행됩니다. 스케일 바:A–E = 2 μm; F–O = 200nm
그림 2 NU‐9 치료는 돌연변이 SOD1 독성으로 인해 질병에 걸린 상위 운동 뉴런(UMN)의 미토콘드리아와 소포체(ER)의 미세구조적 완전성을 개선합니다. (A) 히트에서 NU-9의 화학 구조를 갖는 NU-9로 이어지는 진행. (B) 생체 내 연구를 위한 실험 설계. (C–F) P120에서 비히클로 처리된 WT‐UeGFP 마우스의 운동 피질에 있는 UMN의 대표적인 전자 현미경(EM) 이미지. 화살표는 손상되지 않은 내막이 있는 미토콘드리아와 손상되지 않은 수조가 있는 ER을 가리킵니다. 스케일 바, C:2μm; D~F:200nm. (G–J) P120에서 비히클로 처리된 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스의 운동 피질에 있는 UMN의 대표적인 EM 이미지. (G) 세포질에는 대부분 주요 핵심 소기관이 없으며, (H) 전자 밀도가 높은 집합체(화살촉)와 큰 물방울이 많이 있습니다. (I) 내부 막(화살촉)의 무결성을 잃거나 전체적인 구조적 손상이 있는 미토콘드리아, (J) ER의 단편화된 조각(화살촉)이 분명합니다. 스케일 바, G:2μm; H–J:200nm. (K–N) 100mg/kg/일 NU‐9로 처리한 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스의 운동 피질에 있는 UMN의 대표적인 EM 이미지. (K) 수많은 소기관의 존재로 세포질의 전반적인 개선. (L) 미토콘드리아는 건강한 것으로 보이며(화살표), 세포질에는 주요 조밀한 응집체와 물방울이 부족합니다. (M) 내부 미토콘드리아 막과 크리스태 구조의 무결성이 복원되고(화살표), (N) ER 수조(화살표)가 단편화 없이 적절한 구조로 배열됩니다. 스케일 바, I:2μm; L~N:200nm. (O) NU-9 치료를 받은 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스의 총 미토콘드리아/UMN 수의 정량화. **p < .006, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. (P) NU-9 치료를 받은 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스에서 건강한 미토콘드리아/UMN의 백분율 정량화. ****p < .0001, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트가 수행됩니다. (Q) NU-9 치료를 받은 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스의 ER 수조/UMN 수의 정량화. *p <.016, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. (R) NU-9 치료를 받은 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스의 ER 수조/UMN의 평균 길이 정량화. **p < .002, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트
그림 3 NU‐9 치료는 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스의 상위 운동 뉴런(UMN)에서 잘못 접힌 SOD1 수준을 감소시킵니다. (A) WT‐UeGFP의 운동 피질에서 잘못 접힌 SOD1 단백질을 인식하는 UMN 및 B8H10 항체 염색의 대표 이미지 또는 (B) 비히클, (C) 20mg/kg/일 NU‐9 또는 (D) 100mg/kg/일 NU‐9로 처리된 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스. 스케일 바, 20μm; n ≥ 3개의 생물학적 복제. (E) 비히클, 20mg/kg/일 NU-9 또는 100mg/kg/일 NU-9로 처리된 WT‐UeGFP 또는 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스의 운동 피질에 있는 UMN의 잘못 접힌 SOD1 형광의 평균 통합 밀도; n ≥ 3개의 생물학적 복제에 대해 평균, SEM 및 개별 데이터 포인트가 표시됩니다. **p < .01, ****p < .0001, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트
그림 4 NU‐9 치료는 잘못 접힌 SOD1 독성으로 인해 질병에 걸린 상위 운동 뉴런(UMN)의 정점 수상돌기 붕괴의 세포구조적 완전성을 개선합니다. (A) WT‐UeGFP의 운동 피질에 있는 UMN 정점 수상돌기의 대표 이미지 또는 (B) 비히클, (C) 20mg/kg/일 NU‐9 또는 (D) 100mg/kg/일 NU‐9로 처리된 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스. 박스 영역은 오른쪽으로 확대되고 추가 예시가 제공됩니다. 스케일 바:50 μm(낮은 배율), 10 μm(높은 배율 삽입); n ≥ 6개의 생물학적 복제. (E)건강하고 손상되지 않은 대표 이미지, (F)병에 걸리고 붕괴되는 정점 수상돌기. 스케일 바:5μm. (G) 운동 피질의 섹션당 액포가 있는 UMN 정점 수상돌기의 평균 비율; n ≥ 6 생물학적 복제에 대해 표시된 평균, SEM 및 개별 데이터 포인트입니다. *p <.05, **p <.01, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트
그림 5 NU‐9 치료는 생체 내에서 잘못 접힌 SOD1 독성으로 인해 질병에 걸린 UMN의 상부 운동 뉴런(UMN) 변성을 감소시킵니다. (A–D) 비히클, 20mg/kg/일 NU-9 또는 100mg/kg/일 NU-9로 처리된 WT‐UeGFP 또는 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스의 운동 피질에 있는 UMN의 대표 이미지. 스케일 바:50μm; n ≥ 5개의 생물학적 복제. (E) 운동 피질의 섹션당 평균 UMN 수; n ≥ 5개의 생물학적 복제에 대해 평균, SEM 및 개별 데이터 포인트가 표시됩니다. *p <.05, ***p <.001, ****p <.0001, 일원 분산 분석에 이어 Tukey 사후 다중 비교 테스트
그림 6 NU-9 치료는 TDP-43 병리로 인해 질병에 걸린 상위 운동 뉴런(UMN)의 미토콘드리아와 소포체(ER)의 미세구조적 완전성을 개선합니다. prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스의 UMN에 있는 미토콘드리아 및 ER 결함은 이전에 발표되었습니다. (A–C) 치료되지 않은 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스의 UMN에 대한 대표적인 전자 현미경 이미지. (A) UMN 소마, 손상되지 않은 소기관이 거의 없습니다. (B) 미토콘드리아는 내부 막의 무결성을 잃습니다(화살촉). (C) ER 수조는 분해되어 파손됩니다(화살촉). (D–F) 100mg/kg/일 NU‐9로 처리된 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스의 UMN에 대한 대표적인 전자 현미경 이미지. (D) 세포구조의 전반적인 개선은 적절한 핵막, 수많은 건강한 소기관의 존재, 전자 밀도가 높은 응집체의 부족으로 입증됩니다. (E) 미토콘드리아는 개선된 내부 막과 크리스태(화살표)(F) 및 리보솜이 부착된 적절한 구조로 배열된 ER 수조(화살표)로 건강해 보입니다. 스케일 바:A,D:2μm; B,C,E,F:200nm. (G) 100mg/kg/일 NU‐9 치료를 받은 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스의 총 미토콘드리아/UMN 수의 정량화; *p < .03. (H) 100mg/kg/일 NU‐9 치료를 받은 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스에서 건강한 미토콘드리아/UMN의 백분율 정량화; ****p < .0001. (I) 100mg/kg/일 NU-9 치료를 받은 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스의 ER 수조/UMN 수 정량화; ***p < .0003. (J) 100mg/kg/일 NU-9 치료를 받은 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스의 ER 수조/UMN의 평균 길이 정량화; ****p < .0001. 일원 분산 분석(ANOVA)과 Tukey의 사후 다중 비교 테스트가 통계 분석에 사용되었습니다.
그림 7 NU-9 치료는 분해되는 정점 수상돌기의 세포구조적 완전성을 개선하고 TDP-43 병리로 인해 질병이 발생하는 상부 운동 뉴런(UMN)의 진행성 변성을 제거합니다. (A) 치료되지 않은 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스 및 (B) 100mg/kg/일 NU‐9로 처리된 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스의 운동 피질에 있는 UMN 정점 수상돌기의 대표 이미지. 박스형 영역은 추가 대표적인 예와 함께 오른쪽으로 확대됩니다. 스케일 바:50 μm(낮은 배율), 10 μm(높은 배율 삽입); n ≥ 3개의 생물학적 복제. (C)건강하고 손상되지 않은 대표 이미지, 그리고(D)병에 걸리고 붕괴되는 정점 수상돌기의 대표 이미지입니다. 스케일 바:5μm. (E) 운동 피질의 단면적당 액포가 있는 정점 수상돌기의 평균 비율; n ≥ 3개의 생물학적 복제에 대해 평균, SEM 및 개별 데이터 포인트가 표시됩니다. **p <.01, ***p <.001, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. (F) 치료되지 않은 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스 및 (G) 100mg/kg/day NU‐9로 처리된 prpTDP‐43A315T의 운동 피질에 있는 UMN의 대표 이미지. 스케일 바:50μm; n ≥ 3개의 생물학적 복제. (H) 운동 피질의 단면적당 평균 UMN 수; n ≥ 3개의 생물학적 복제에 대해 평균, SEM 및 개별 데이터 포인트가 표시됩니다. *p <.05, **p <.01, ***p <.001, 일원 분산 분석에 이어 Tukey 사후 다중 비교 테스트
그림 8 NU‐9 치료는 생체 내에서 잘못 접힌 SOD1 독성으로 인한 하부 운동 뉴런(LMN) 퇴행을 개선하지 않습니다. (A 및 B) 치료되지 않은 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스 또는 100mg/kg/일 NU‐9로 치료된 요추 척수의 LMN 대표 이미지. 스케일 바:50μm; n ≥ 3개의 생물학적 복제. (C–F) 비히클, 20mg/kg/일 NU-9 또는 100mg/kg/일 NU-9로 처리된 WT‐UeGFP 또는 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스의 요추 척수의 LMN 대표 이미지. 스케일 바:50μm; n==5개의 생물학적 복제. (G) 요추 척수의 섹션당 ChAT+ LMN의 평균 수; n =5개의 생물학적 복제물에 대해 평균, SEM 및 개별 데이터 포인트가 표시됩니다. ****p < .0001, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트가 수행됩니다. (H) 요추 척수의 섹션당 NeuN+/ChAT+ LMN(변성에 취약함)의 평균 수; n =5개의 생물학적 복제물에 대해 평균, SEM 및 개별 데이터 포인트가 표시됩니다. ****p < .0001, 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트가 수행됩니다. (I) 요추 척수의 섹션당 평균 GFP+/ChAT+ LMN(변성에 대한 저항성) 수; n = 5개의 생물학적 복제에 대해 표시된 평균, SEM 및 개별 데이터 포인트
그림 9 NU-9 치료 유무에 관계없이 WT‐UeGFP, hSOD1G93A‐UeGFP 및 prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스의 행동 데이터. WT‐UeGFP 및 hSOD1G93A‐UeGFP 마우스는 출생 후(P)60과 P120 사이에 7일마다 테스트되었습니다. prpTDP‐43A315T‐UeGFP 마우스는 P60, P90 및 P120에서 테스트되었습니다. (A) 마우스의 무게(그램)입니다. 그룹당 n≥5마리의 마우스에 대한 평균 및 SEM이 표시됩니다. WT‐UeGFP(차량) 대 hSOD1G93A‐UeGFP(차량); #p <.05, Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 양방향 ANOVA. (B) 로타로드를 초 단위로 가속할 때 발생하는 지연 시간입니다. 그룹당 n≥5마리의 마우스에 대한 평균 및 SEM이 표시됩니다. WT‐UeGFP(차량) 대 hSOD1G93A‐UeGFP(차량). #p <.05, ##p <.01, ###p <.001, ####p <.0001, Tukey 다중 비교 테스트를 통한 양방향 ANOVA. (C) 몇 초 만에 와이어 그리드에 거꾸로 매달려 떨어지는 지연 시간입니다. 그룹당 n≥5마리의 마우스에 대한 평균 및 SEM이 표시됩니다. WT‐UeGFP(차량) 대 hSOD1G93A‐UeGFP(차량). #p < .05, ###p < .001, ####p < .0001; hSOD1G93A‐UeGFP(차량) 대 hSOD1G93A‐UeGFP(NU‐9 100mg/kg/일). *p <.05, ***p <.001, ****p <.0001, Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 양방향 ANOVA. (D) 로타로드를 초 단위로 가속할 때 발생하는 대기 시간입니다. 그룹당 n≥4마리의 마우스에 대한 평균 및 SEM이 표시됩니다. WT‐UeGFP(차량) 대 prpTDP‐43A315T‐UeGFP(차량). ##p < .01, ####p < .0001, Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 혼합 효과 분석. (E) 몇 초 만에 와이어 그리드에 거꾸로 매달려 떨어지는 지연 시간입니다. 그룹당 n≥3마리의 마우스에 대한 평균 및 SEM이 표시됩니다. WT‐UeGFP(차량) 대 prpTDP‐43A315T‐UeGFP(차량), ####p <.0001; prpTDP‐43A315T‐UeGFP(미처리) 대 prpTDP‐43A315T‐UeGFP(NU‐9 100 mg/kg/일), ****p < .0001, Tukey 다중 비교 테스트를 통한 혼합 효과 분석